肖學敏 何艷艷 徐浩翔 王寶璽 林立航

1福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，福州350001；2中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院，南京210042；3中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 整形外科研究所皮膚科，北京100144

反常性痤瘡（acne inversa，AI；OMIM 142690），又稱化膿性汗腺炎，是一種好發(fā)于皺褶部位的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病。2010 年，王寶璽等［1］首先發(fā)現編碼γ 分泌酶（γ-secretase，GS）不同亞單位的基因突變可引起部分家族性AI 的發(fā)生。γ分泌酶包含4 個必要組分，分別為早老素1（presenilin-1，PSEN1）、nicastrin 蛋白（NCSTN）、前咽缺陷蛋白（anterior pharynx defective-1，APH1）和早老素增強子2（presenilin enhancer-2，PEN2）。目前已在AI患者的γ分泌酶基因上發(fā)現41個不同的突變位點，其中NCSTN 基因突變27 個，均為功能缺失性突變［2-3］。NCSTN 亞基屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩(wěn)定，此外還具有募集γ 分泌酶底物的功能，其表達異?？蓪е娄梅置诿富钚院凸δ苁軗p［4］。目前認為毛囊栓塞為AI 的初始及最主要致病因素，NCSTN 基因功能缺失性突變導致γ分泌酶-Notch信號通路表達及活性受損，進而影響角質形成細胞正常增殖和分化，可能在AI 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［5］。然而近期的研究顯示，某些NCSTN 基因的功能缺失性突變并不影響Notch信號通路的正?；罨?，說明可能還有其他增殖和分化相關的細胞信號通路參與AI 發(fā)?。?］。我們通過沉默人永生化角質形成細胞HaCaT中NCSTN基因的表達，研究其下游細胞增殖及分化相關信號通路的改變。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑和儀器：人永生化角質形成細胞株HaCaT 細胞源自美國ATCC 細胞庫。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國GIBCO 公司）；Trizol 核酸抽提試劑、Opti-MEM?I 減血清培養(yǎng)基、Lipofectamine?2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）；DNA 分子標志物、5 × DNA Loading Buffer、PrimeScript?RT-PCR試劑盒、TaqTMRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa 公司）；UltraPowerTM核酸染料（北京BioTeke 公司），EvaGreen 染料（美國Biotium 公司）；RIPA裂解液、cocktail蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配制試劑盒（南京碧云天公司）；綿羊抗人NCSTN 多克隆抗體（美國R＆D 公司）；鼠抗綿羊β肌動蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機（美國Thermo 公司），GeneAmp System 9700 PCR 儀、ABI 7300 Real Time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2. 引 物 及siRNA：NCSTN - siRNA 由 美 國Invitrogen 公司合成，序列如下：正義鏈5′-UGUUAUGGAAGGCACCAGAGUGGUC-3′，反義鏈3′-GACCACUCUCUGGUGCCUUCCAUAACA-5′；另由Invitrogen 公司合成一個標準的錯配siRNA（mismatch-siRNA control，m-siRNA）作為陰性對照。實時定量PCR 引物利用Primer5.0 程序設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及實驗分組：將HaCaT 細胞以1×106/ml 接種于25 ml 培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清以及青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 mg/L）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染前1天，按每孔2×105個細胞接種在6孔板板孔上，當細胞融合度達到30%～40%時，將HaCaT 細胞分為3 組，干擾組轉染100 pmol 特異性NCSTN-siRNA，陰性對照組轉染等量m-siRNA，空白對照組僅加等量轉染試劑，根據Lipofectamine?2000 說明書進行轉染。轉染后72 h收集細胞進行后續(xù)實驗。

2.表達譜芯片檢測干擾組和陰性對照組全基因組mRNA的差異表達：所用芯片為上海康成生物工程有限公司提供的Agilent 人類全基因組表達譜芯片（4×44K）。干擾組和陰性對照組每組進行3次生物學重復，共6 張芯片。用Trizol 試劑分別提取兩組細胞的總RNA，用NanoDrop ND-1000 定量并經變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度。RNA質檢合格后，將總RNA 反轉錄成雙鏈cDNA，再進一步合成用花青素-3-三磷酸胞苷（Cy3）標記的cRNA。將標記好的cRNA 和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C 掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction 軟件（version11.0.1.1）處理原始圖像提取原始數據，再使用GeneSpring GX 軟件（version11.5.1）進行數據標準化及后續(xù)處理。將讀取的數據進行歸一化處理后篩選出差異表達基因，并對差異表達基因進行基因表達譜本體（GO）分析。

3.實時PCR 驗證差異表達基因mRNA 表達的改變：利用與芯片同一批組織樣提取RNA 進行熒光定量PCR 驗證，選取芯片結果顯示差異表達的6條基因即NCSTN、Sprouty相關蛋白2(SPRED2)、表皮生長因子7（FGF7）、胰島素樣生長因子結合蛋白5（IGFBP5）、人Rho 關聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2（ROCK2）和骨形成發(fā)生蛋白6（BMP6）基因，以人β肌動蛋白作為內參基因驗證芯片結果的可靠性。將樣本RNA按PrimeScript?RT-PCR試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，再根據TaqTMRT-PCR 試劑盒說明書進行PCR反應。PCR反應體系包括12 μl預配混合液、正反向引物各1 μl、Taq 酶1 μl、EvaGreen 2.5 μl、cDNA 2.5 μl，加入無核酶水補足至50 μl。將PCR 反應體系置于ABI 7300 Real Time PCR 儀進行實時熒光定量PCR反應。反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2-△△Ct法對實時PCR結果進行數據分析，△Ct值表示循環(huán)數，△△Ct目的基因=△Ct目的基因-△Ctβ肌動蛋白，目的基因的相對表達量=2-△△Ct。另行瓊脂糖凝膠電泳確認擴增反應產物的單一性。

4. Western 印跡法檢測細胞NCSTN 蛋白表達的改變：收集干擾組、陰性對照組及空白對照組HaCaT 細胞，冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2 次，加適量預冷的細胞裂解液，4 ℃裂解細胞后收集總蛋白。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后取適量變性的蛋白樣品，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電泳20 min，再于130 V電泳50 min后轉膜至聚偏二氯乙烯膜上，用含5%牛血清白蛋白的三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液浸泡聚偏二氯乙烯膜，室溫搖床封閉2 h。將封閉過的膜加入一抗綿羊抗人NCSTN多克隆抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，用二抗鼠抗綿羊β肌動蛋白單克隆抗體（1∶200稀釋）孵育2 h 后進行化學發(fā)光顯影。以β 肌動蛋白作為內參。用Gel-Pro analyzer 軟件分析各條帶灰度值，用每組細胞各自的β 肌動蛋白作歸一化處理，再將空白對照組作為1，其余以比值表示，代表相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列

5.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，數據以±s 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。P ＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、轉染特異性NCSTN-siRNA 后HaCaT 細胞NCSTN mRNA及蛋白表達情況

瓊脂糖凝膠電泳顯示，轉染NCSTN-siRNA 后HaCaT 細胞NCSTN 基因PCR 擴增片段與所設計大小一致，且較陰性對照組及空白對照組表達水平明顯下降（圖1A）。實時PCR 顯示，干擾組NCSTN mRNA 的相對表達量為0.287±0.090，陰性對照組0.969 ± 0.127，空白對照組1.000 ± 0.151，3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F =30.787，P=0.001），且干擾組與陰性對照組及空白對照組相比差異都有統(tǒng)計學意義（P 值分別為0.001、0.000）。3 組細胞均表達NCSTN（圖1B），干擾組NCSTN 蛋白相對表達量為0.443±0.085，陰性對照組為1.047±0.114，空白對照組為1.000 ± 0.111，3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=31.139，P=0.001），且干擾組與陰性對照組及空白對照組相比差異都有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.000、0.001）。上述結果提示NCSTN-siRNA 在mRNA及蛋白水平干擾效率良好，可以單獨用于后續(xù)試驗。

二、RNA質控分析

圖1 nicastrin（NCSTN）-siRNA 轉染后干擾效率驗證 1A：實時PCR 檢測各組HaCaT細胞NCSTN mRNA表達；1B：Western印跡檢測各組HaCaT細胞NCSTN蛋白表達

分光光度計顯示，干擾組與陰性對照組6份樣本A260/A280 值均十分接近2.0，A260/A230 值均大于1.8，說明RNA純度高，達到試驗的要求。RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，28SrRNA、18SrRNA條帶清晰，5SrRNA條帶模糊，表明RNA完整性和純度較好。RNA濃度為861.05 ～1 247.71 mg/L，每管樣本共20 μl，樣本量充足。

三、差異表達基因、分層聚類圖分析

篩選差異表達基因的標準為上調或者下調倍數值≥2.0 且P ≤0.05。芯片結果顯示，干擾組NCSTN 基因mRNA 表達水平只有陰性對照組的25%左右，說明干擾效率良好。與陰性對照組相比，干擾組表達下調基因605 個，上調基因444 個?；趦山M細胞差異表達基因得到的分層聚類分析圖顯示，兩組間有明顯的表達譜差異，而組內無明顯差異，證明樣本的重復性較好（圖2）。

四、GO分析

運用Agilent GeneSpring GX software 對表達譜芯片干擾組與陰性對照組的差異基因進行GO 分析。GO 分析包括生物學過程、細胞成分及分子功能3部分。富集歸類圖顯示，干擾組與陰性對照組之間的差異表達分子在上皮發(fā)育、上皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化4種生物學過程富集程度排在第1、2、4、5位，角質化包膜、胞外段部分、蛋白胞外基質、胞外段、錨定質膜胞外側5 種細胞成分富集程度排在第1、3、7、8、10位。見圖3。

五、實時PCR驗證全基因組表達譜芯片結果

驗證結果顯示，與陰性對照組相比，干擾組SPRED2、ROCK2 和BMP6 基因表達下調，FGF7 和IGFBP5 基因表達上調，和芯片分析結果中差異表達趨勢一致（P ＜0.01），見圖4。

討 論

由于毛囊上皮細胞的增殖和分化異常是AI的發(fā)病基礎，我們在芯片的海量信息中主要關注上皮細胞增生分化及相關信號通路的分子表達情況。生物學過程富集歸類圖顯示，干擾NCSTN 基因表達后對上皮發(fā)育、上皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化4 種生物學過程影響最為顯著。提示NCSTN 基因在維持角質形成細胞正常增殖及分化等自穩(wěn)性的生理過程中發(fā)揮作用，干擾NCSTN 基因的表達可能導致角質形成細胞增殖過度及異常分化。細胞成分富集歸類圖顯示，干擾NCSTN 基因表達影響細胞的角質化包膜及胞外段。角質化包膜由多種谷氨酰轉移酶共價連接的蛋白組成，發(fā)揮皮膚屏障的作用，代表角質形成細胞的終末分化；角質化包膜的改變也說明沉默NCSTN 基因的表達可干擾角質形成細胞的正常分化。而胞外段是NCSTN 基因識別及結合底物的部位，胞外段的改變說明干擾NCSTN基因的表達可損害其識別及結合底物的功能，從而可能影響γ分泌酶復合體的酶解活性。我們篩選出5 條有重要意義的差異表達的細胞增殖分化相關基因進行實時PCR驗證，驗證結果與芯片檢測結果趨勢一致，顯示芯片結果可信。

圖2 干擾組和陰性對照組HaCaT 細胞差異表達基因聚類圖分析 橫坐標表示樣本，縱坐標表示差異基因，紅色代表顯著上調，綠色代表顯著下調；C1 ～C3代表3個陰性對照組樣本，N1 ～N3代表3個干擾組樣本

圖3 NCSTN基因沉默的HaCaT細胞前10位富集程度最高的生物學過程（3A）及細胞成分（3B） 可見角質形成細胞增生分化相關的生物學過程及細胞成分差異基因富集程度最高

圖4 實時PCR 驗證表達譜芯片檢測出的5 條差異表達基因各基因在干擾組和陰性對照組樣本間的表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）

Ras-MAPK-ERK 通路在調節(jié)角質形成細胞的增殖與分化中發(fā)揮重要作用，其異?；罨蓪е陆琴|形成細胞的過度增殖和異常分化［7］。我們發(fā)現Ras-ERK 通路的靶基因SPRED2 的改變，SPRED2同時也是負性調節(jié)因子。作為Sprouty（SPRY）蛋白家族的成員，SPRED2可通過抑制Ras的激活，拮抗血管內皮細胞生長因子及FGF 相關信號通路的生物學作用［8］。其中，FGF7 不但能明顯刺激表皮角質形成細胞生長，還能促進毛囊和皮脂腺的角質形成細胞生長，是迄今為止發(fā)現的最強的角質形成細胞生長因子［9］。FGFR2b與FGF7結合后活化，可調控角質形成細胞的增殖和活化［10］。我們發(fā)現干擾組FGF7 表達水平上升?；谏鲜鼋Y果，我們推測NCSTN基因表達下調可通過抑制SPRED2表達，激活Ras-MAPK-ERK介導的受體酪氨酸激酶FGF7-FGFR信號轉導通路，導致角質形成細胞的異常增殖和分化。

在胰島素-胰島素樣生長因子（IGF）信號轉導通路中，IGF 家族由于可調控角質形成細胞的增殖、分化、遷移和黏附，參與皮膚腫瘤和銀屑病的發(fā)生發(fā)展［11］。IGF 家族包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種生長因子，IGF 結合蛋白（IGFBP）可調節(jié)IGF 的活性。IGF-Ⅱ可直接結合細胞外基質的玻連蛋白，而IGF-Ⅰ卻無法結合。研究表明IGFBP5可使IGF-Ⅰ易于結合玻連蛋白，形成IGF-Ⅰ/IGFBP5/玻連蛋白復合物，從而促進角質形成細胞的增殖和遷移。本研究中，NCSTN基因表達下調可促進IGFBP5的表達，結合文獻，推測其可能通過增強與IGF-Ⅰ的結合發(fā)揮作用。

絲氨酸/蘇氨酸激酶ROCK 是小GTP 酶RhoA的下游效應分子，包括ROCK1 和ROCK2，在調節(jié)角質形成細胞黏附和促進其終末分化中發(fā)揮重要作用［12］。激活ROCK2的表達可誘導角質形成細胞分化標志的產生［13］；使用ROCK分子的選擇性阻斷劑可完全抑制表皮角質形成細胞分層的形成，說明ROCK 信號通路的表達缺失可抑制角質形成細胞的終末分化［14-15］。因此，NCSTN基因表達下調可能通過抑制RhoA/ROCK2信號通路，抑制角質形成細胞的分化，促進其增殖。

骨形成發(fā)生蛋白BMP6屬于轉化生長因子β超家族成員，該家族成員在調控細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。BMP6可促進角質形成細胞早期分化標記角蛋白1和10的表達，促進角質形成細胞的分化［16］。Gosselet等［17］也發(fā)現，BMP6可通過抑制表皮干細胞的增殖，從而阻遏角質形成細胞的增殖，誘導其終末分化，這種作用可能有細胞周期素依賴激酶抑制蛋白P57 的參與。本研究中芯片及實時PCR 結果顯示，沉默NCSTN 基因表達后可能通過抑制BMP信號轉導通路影響角質形成細胞的正常增殖和分化。

本實驗中篩選出的NCSTN 基因干擾組與陰性對照組的重要差異表達基因，較多參與角質形成細胞增殖分化相關信號通路，提示NCSTN 基因功能缺失性突變可導致角質形成細胞異常的增殖分化。差異基因的生物信息學分析為我們今后的研究奠定了基礎，后續(xù)我們將挑選感興趣的基因在蛋白水平、原代角質形成細胞和動物模型上做深入的研究，并在人AI皮損中進行驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突