胡翠 李巍 張婷 魯慧 吳亞芳 錢華

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院皮膚科215025

長期慢性紫外線照射可誘導皮膚成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMP）合成、線粒體損傷、蛋白質氧化損傷和端?？s短等，使皮膚加速衰老甚至出現癌變［1-2］。本研究小組前期發(fā)現，微小RNA（miRNA）-1246是紫外線照射誘導光老化中出現顯著下調的miRNA之一［3］，其靶點基因絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14，又稱p38）是MAPK 信號通路關鍵分子，與MMP 及膠原降解等細胞光老化機制具有密切關系。本研究通過建立長波紫外線（UVA）照射誘導的人皮膚原代成纖維細胞（HSF）的光老化模型，檢測miR-1246和MAPK14 的表達，并用慢病毒轉染上調miR-1246 的表達，觀察其對細胞增殖和光老化的影響，探討其內在的分子機制。

材料與方法

一、材料與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；UVA 照射儀（上海希格瑪公司）；Dispase酶、膠原酶（美國Sigma公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen 公司）；MAPK14 鼠單克隆抗體（美國Sigma 公司）；MMP-1 兔單克隆抗體（美國Abcam公司）；增強化學發(fā)光試劑（ECL）（美國Bethyl 公司）；山羊抗兔IgG抗體、山羊抗小鼠IgG抗體（上海碧云天生物技術研究所）；人源has-miR-1246 慢病毒表達載體、慢病毒轉染試劑盒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；噻唑藍（MTT，美國Sigma公司），實時定量PCR 試劑盒、SYBR 熒光染料試劑（日本Takara 公司）；ABI7300 實時定量PCR 儀（美國ABI公司）。

二、HSF的分離和培養(yǎng)

HSF分離自本院泌尿外科收集的5例3 ～12歲健康兒童包皮環(huán)切術后皮膚標本。本研究通過蘇州大學附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批號：2020CS003），患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。

包皮標本用含1%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，清除皮下脂肪和血管后，將標本剪成寬為3 mm 的皮條，使用Dispase 酶在37 ℃消化3 ～4 h，分離表皮與真皮。將真皮剪成碎沫后再使用膠原酶于37 ℃消化2 ～4 h。過200 目篩網收集細胞懸液，離心后將細胞重懸于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數生長期細胞傳代，用于進一步實驗。

三、連續(xù)UVA照射誘導HSF老化

取對數生長期HSF，加入少量PBS覆蓋培養(yǎng)皿底面，置于冰水中，用紫外線治療儀（型號SS-04，UVA：320 ～400 nm）進行照射，單次照射780 s，劑量為10 J/cm2，照射后棄PBS，重新加入培養(yǎng)基，于次日再次重復操作，連續(xù)照射14 d，于首次照射后和照射后第3、7、14天，采用RT-PCR檢測miR-1246的相對表達，以相同處理不照射UVA 的細胞為對照。

四、RT-PCR檢測目的基因的相對表達

取各實驗組細胞，按Trizol 試劑盒方法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。使用SYBR Green I 染料法進行相對定量分析。采用20 μl 反應體系，引物由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，序列見表1。擴增條件：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。每個樣品設3 個復孔，結果取平均值，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達值。

五、慢病毒轉染上調HSF 細胞miR-1246 的表達及驗證

取對數生長期HSF 細胞，按照慢病毒轉染手冊，轉染以異硫氰酸熒光素（FITC）標記的miR-1246 慢病毒表達載體至HSF 細胞，慢病毒表達載體的構建和鑒定由上海諾百生物技術有限公司完成，將細胞分為轉染FITC-miR-1246 的miR-1246轉染組以及轉染FITC-miR無義序列的陰性對照組和不做任何處理的空白對照組，觀察轉染后第7、14 天時細胞的熒光情況以確定轉染效率，通過RT-PCR檢測miR-1246的相對表達。

六、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-1246與靶點基因MAPK14結合

通過miRNA 靶基 因 預 測網站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）分析miR-1246 與靶點基因MAPK14的互補序列，由上海諾百生物技術有限公司構建合成有互補序列的野生型（WT）MAPK14及無互補序列的突變型（MUT）MAPK14 熒光素酶報告基因質粒（圖1），分別與miR-1246及其空白質粒共轉染于24 孔人胚胎腎細胞（HEK293T）培養(yǎng)板，48 h后收取細胞，PBS洗2遍，每孔加100 μl被動裂解緩沖液，水平搖床裂解20 min，吹打均勻，吸取20 μl細胞裂解液于酶標板，加入50 μl熒光素酶分析緩沖液，檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入50 μl 底物緩沖液，立即檢測海腎熒光素酶活性，記錄前后兩次測得熒光數據，其比值代表各孔樣本的相對熒光強度，配對程度越高相對熒光強度越低。

七、UVA 照射及上調miR-1246 的表達對HSF細胞的影響

取對數生長期細胞，分為4 組，分別是空白對照組、UVA 組（按照方法三的劑量連續(xù)照射）、miR-1246組（轉染has-miR-1246）、UVA+miR-1246組（轉染has-miR-1246，按照方法三的劑量連續(xù)照射），14 d 后，收集各組細胞，采用MTT 檢測細胞增殖活性，β半乳糖苷酶染色檢測細胞老化，RT-PCR及Western 印跡檢測MMP-1、MAPK14 mRNA 及蛋白的表達。

1.MTT 檢測細胞增殖活性：取各組細胞，調整為5×104～10×104/ml 的細胞懸液，取100 μl 加入96 孔板，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每組設5 個復孔。更換培養(yǎng)基，每孔加20 μl MTT（5 g/L）溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使用酶標儀于490 nm測定各孔吸光度（A值），反映細胞增殖活性。

2.β半乳糖苷酶染色檢測細胞老化：取各組細胞，使用PBS清洗后加入適量細胞固定工作液固定細胞，采用PBS 清洗后，加入細胞染色工作液于37 ℃孵育20 min至16 h，至光鏡下觀察出現藍染的陽性細胞；棄去染色工作液，用PBS清洗；隨機挑選3 處視野，采用德國ZEISS 公司VIDAS 型計算機全自動圖像分析系統(tǒng)計算β 半乳糖苷酶表達陽性細胞比率，陽性細胞率（%）= 藍染細胞面積/細胞總面積×100%。

圖1 根據miR-1246與MAPK14基因之間的互補序列設計的互補和不互補序列 野生型（WT）有互補序列，突變型（MUT）無互補序列

表1 引物序列

3.Western印跡檢測蛋白表達：取各組細胞，裂解后收集上清液，進行蛋白定量。各組取等量蛋白，經電泳、轉膜、封閉，分別與MMP-1 抗體及MAPK14抗體（1∶1 000）孵育過夜；洗滌后與相應的二抗結合反應，使用ECL發(fā)光顯色，以GAPDH作為參照，目的條帶灰度值與GAPDH 條帶的比值為相對表達水平。

八、統(tǒng)計學處理

結 果

一、UVA照射對HSF中miR-1246表達的影響

起始時照射UVA與照射3 d時，UVA組與對照組miR-1246 的相對表達差異均無統(tǒng)計學意義（t=1.29、2.52，均P ＞0.05）。在照射7 d、14 d 時，UVA組均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=29.84、31.93，均P ＜0.01）。見圖2。

二、慢病毒載體介導miR-1246 過表達及實時定量PCR 驗證

轉染后7、14 d 時的轉染效率均大于90%（圖3）。RT-PCR 顯示，轉染后7、14 d 時miR-1246表達水平（10.15 ± 0.18、9.79 ± 0.40）高于對照組（4.20 ± 0.34、3.61 ± 0.34），差異有統(tǒng)計學意義（t =22.72、41.92，P均＜0.01）；轉染組7、14 d 的miR-1246相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.56，P ＞0.05）。

圖2 RT-PCR 檢測UVA 照射對人皮膚原代成纖維細胞miR-1246表達的影響 a：兩組比較，P ＜0.05

三、miR-1246與靶點基因MAPK14結合的驗證

與野生型MAPK14 雙熒光素酶報告載體共轉染時，miR-1246 質粒組細胞熒光活性（0.41±0.09）低于空白質粒組（1.22±0.218），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.69，P ＜0.05）；與突變型MAPK14雙熒光素酶報告載體共轉染時，miR-1246 質粒組細胞熒光活性（1.16±0.16）與空白質粒組（1.21±0.18）差異無統(tǒng)計學意義（t=0.25，P=0.82）。

四、上調miR-1246 表達對HSF 細胞增殖的影響

MTT結果顯示，空白對照組、UVA組、miR-1246組、UVA+miR-1246組細胞增殖活性（0.82±0.03、0.23±0.02、0.81±0.02、0.61±0.02）差異有統(tǒng)計學意義（F = 34.90，P ＜0.05），UVA 組低于空白對照組（t = 28.14，P ＜0.01）；UVA + miR-1246 組低于miR-1246 組（t=10.61，P ＜0.01），高于UVA 組（t=20.30，P ＜0.01）。

五、上調miR-1246 表達對HSF 細胞增殖的影響

β 半乳糖苷酶染色檢測顯示，空白對照組、UVA組、miR-1246組、UVA+miR-1246組陽性細胞率（3.93%±1.11%、81.29%±2.53%、5.50%±1.15%、54.13% ± 2.09%）差異有統(tǒng)計學意義（F = 16.14，P ＜0.05），其中UVA組高于空白對照組（t=48.46，P ＜0.01）；而UVA+miR-1246 組高于miR-1246 組（t = 35.31，P ＜0.01），低于UVA 組（t = 14.32，P ＜0.01）。見圖4。

六、上調miR-1246 表達對老化相關基因的影響

圖3 熒光顯微鏡觀察轉染熒光標記的miR-1246表達載體的人皮膚原代成纖維細胞轉染效率 轉染后7、14 d時轉染率均大于90%

圖4 β 半乳糖苷酶染色檢測上調miR-1246 表達對人皮膚原代成纖維細胞老化的影響 UVA 組老化細胞比例高于空白對照組；而UVA+miR-1246組高于miR-1246組，低于UVA組

RT-PCR 顯示，空白對照組、UVA 組、miR-1246組、UVA + miR-1246 組MAPK14 mRNA、MMP-1 mRNA 的相對表達差異均有統(tǒng)計學意義（F =15.24、34.56，均P ＜0.05），其中UVA組高于空白對照組（t = 10.49、7.70，P ＜0.05），UVA + miR-1246組高于miR-1246 組（t=11.58、12.60，P ＜0.01），低于UVA組（t=11.63、6.17，P ＜0.05）。見圖5。

七、上調miR-1246 表達對老化相關基因蛋白表達的影響

Western 印跡顯示，空白對照組、UVA 組、miR-1246 組、UVA+miR-1246 組MAPK14、MMP-1的相對表達差異均有統(tǒng)計學意義（F = 23.56、32.74，P ＜0.05），其中UVA 組高于空白對照組（t=12.53、15.35，P ＜0.05），UVA + miR-1246 組高于miR-1246 組（t=24.78、32.15，P ＜0.01），低于UVA組（t=10.43、15.64，P ＜0.05）。見圖6。

討 論

圖5 RT-PCR 檢測上調miR-1246 表達對人皮膚原代成纖維細胞MAPK14、MMP-1 mRNA表達的影響 a：兩組比較，P ＜0.05

光老化是一個復雜的過程，由多種基因和生長因子共同調控。UVA 照射在光老化的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。miRNA 是一類具有轉錄調節(jié)功能的非編碼小RNA，其在多種生理和病理過程如基因表達、細胞增殖、分化、凋亡、組織代謝和腫瘤生成中有重要作用［4］。miR-1246位于人2q31.1，通常與其靶基因mRNA以序列互補性的機制負調控靶基因，作用方式是miR-1246 5′端種子序列（第2-7nt）與靶基因mRNA 3′UTR區(qū)進行堿基配對，配對的緊密程度決定miRNA對靶基因的抑制程度［5-6］。

圖6 上調miR-1246 表達對對人皮膚原代成纖維細胞老化相關蛋白水平的影響 6A：Western 印跡檢測MAPK14、MMP-1蛋白的水平；6B：a，兩組比較，P ＜0.05

本研究證實，UVA 照射可以誘導miR-1246 表達下調。通過miR-1246慢病毒表達載體轉染成纖維細胞，上調miR-1246 的表達并維持在較高水平后發(fā)現，miR-1246 的表達上調能促進UVA 誘導的光老化細胞的增殖活性，β半乳糖苷酶染色檢測亦顯示，上調miR-1246 的表達可降低UVA 誘導的光老化細胞比例。以上均提示，上調miR-1246 的表達可以抑制UVA 照射誘導的細胞老化，miR-1246具有抗光老化作用。

近來研究發(fā)現，p38 信號通路是MAPK 通路的一個重要分支，它在炎癥細胞、應激、凋亡、細胞周期和生長等多種生理和病理過程中起重要作用。MMP-1 是皮膚光老化的主要相關蛋白酶，也是MAPK信號轉導通路的下游效應分子，并可降解多種膠原和蛋白聚糖，對于維持皮膚的光澤和彈性具有重要作用［7］。本研究中，UVA照射成纖維細胞后MAPK14 以及MMP-1 mRNA 及蛋白表達水平均顯著增高。既往文獻顯示，p38激活可使轉錄激活因子AP-1 活化，與MMP-1 基因結合，促進MMP-1 轉錄，使之水平增加［8］，本文結果與之相符，與之對應的是UVA 照射后成纖維細胞增殖活性下降，老化細胞比例增加。

進一步研究發(fā)現，上調成纖維細胞miR-1246的表達，可下調MAPK14、MMP-1 mRNA 及蛋白的表達，同時MTT 結果顯示，上調miR-1246 表達后照射UVA 較單純照射UVA 組細胞活性增加，老化細胞比例降低。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)也驗證了miR-1246 有MAPK14 mRNA 靶向結合的能力。因此，我們推測UVA 照射可能通過降低miR-1246表達，上調基因MAPK14的表達，活化MAPK 信號轉導通路，促進MMP-1 增加，加速成纖維細胞光老化，增殖活性下降。

綜上，本研究證實，miR-1246在UVA誘導的光老化細胞顯著下調，上調其表達則能提高光老化細胞的增殖能力，降低老化相關蛋白的表達，而miR-1246 的調控作用可能是通過作用于靶基因MAPK14 實現，提示miR-1246 的表達下調在UVA誘導光老化的形成和進展中可能發(fā)揮重要的作用。

此外，本實驗并未進行下調miR-1246 表達后是否會促進UVA 誘導的光老化、降低細胞增殖活性的研究，有待進一步證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突