鄭 晗 周冬梅,2 苗 蓓,3 李 偉,2*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇徐州 221002；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇徐州 221002)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)是以腹脹、早飽、厭食、噯氣、惡心、體質(zhì)量下降等為典型表現(xiàn)的糖尿病慢性合并癥之一。DGP嚴(yán)重降低糖尿病患者的生活質(zhì)量，多達(dá)50%的DGP患者出現(xiàn)明顯的焦慮和/或抑郁(伴腹痛者尤甚)[1]。另外，DGP會(huì)加重糖尿病患者血糖控制難度，增加患者的住院率，加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。因此，探究DGP的發(fā)病機(jī)制并找到行之有效的防治辦法對(duì)糖尿病患者而言尤為重要。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病各種慢性合并癥的統(tǒng)一發(fā)生機(jī)制[3]，在DGP發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃慢波活動(dòng)的起搏細(xì)胞，可以生成和傳播調(diào)節(jié)胃腸平滑肌收縮的電信號(hào)。研究[4]顯示，DGP的發(fā)生與氧化應(yīng)激所致ICC網(wǎng)絡(luò)受損有關(guān)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性脫乙酰基酶，主要通過(guò)使許多類(lèi)型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和輔因子脫乙?；?，如：P53、核因子- κB(nuclear factor κB，NF-κB)、O型叉頭轉(zhuǎn)錄因子盒蛋白(forkhead box protein，F(xiàn)OXO)和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體共激活因子1(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator，PGC-1)，參與細(xì)胞周期停滯和衰老，這些因素可能會(huì)影響與諸如糖尿病等代謝性疾病有關(guān)的細(xì)胞途徑[5]，SIRT1與糖尿病及相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。SIRT1可以通過(guò)改善線粒體的氧化代謝，并在氧化應(yīng)激下正向調(diào)節(jié)線粒體功能，以抵御氧化損傷[6]。因此，上調(diào)SIRT1可能改善糖尿病小鼠的胃排空延遲。

血紅蛋白氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)被認(rèn)為是可以對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要的細(xì)胞防御機(jī)制[7]，HO-1的轉(zhuǎn)錄是由多種氧化還原依賴(lài)性信號(hào)通路如促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，特別是轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)性因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)誘導(dǎo)的[8]。BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology 1，Bach1)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)的偶聯(lián)，進(jìn)而下調(diào)抗氧化因子HO-1的基因轉(zhuǎn)錄[9]。SIRT1也可以調(diào)控HO-1基因轉(zhuǎn)錄[10]。因此，上調(diào)SIRT1可能通過(guò)下調(diào)組織中Bach1蛋白濃度，進(jìn)一步調(diào)控HO-1的基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗氧化作用。這可能成為DGP防治的新的靶點(diǎn)。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，具有顯著的抗氧化活性。Res也是SIRT1的激活劑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，線粒體生物合成以及脂質(zhì)和碳水化合物代謝，其抗氧化、抗炎、抗癌和心血管保護(hù)作用已在實(shí)驗(yàn)[11]中得到證實(shí)，但是Res作為SIRT1激活劑是否可以改善DGP小鼠的胃排空延遲，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)主要探究SIRT1對(duì)DGP小鼠胃排空影響以及可能的作用機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療DGP患者提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量20～23 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003。室溫(23±1) ℃，12 h光照周期，自由飲水?dāng)z食。該研究得到徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),倫理委員會(huì)審批號(hào)：2016036。

1.2 藥物與試劑

Res(美國(guó)MCE公司)，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國(guó)Sigma公司)；小鼠抗兔SIRT1多克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司)，小鼠抗兔Bach1多克隆抗體(美國(guó)ABclonal公司)，小鼠抗兔c-kit多克隆抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司)，小鼠抗兔HO-1多克隆抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)公司 )，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)公司 )。

1.3 分組、造模

實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。6周齡C57BL/6J小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、溶劑對(duì)照組和Res組。除空白組小鼠以外，其余小鼠按160 mg/kg一次性腹腔注射STZ[以1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶于枸櫞酸鈉緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用]，保證充足的飼料和飲用水?？瞻捉M小鼠腹腔注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。造模72 h 后采集尾靜脈血檢測(cè)隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥ 16.7 mmol/L為模型制備成功。

1.4 藥物干預(yù)

模型建立成功后進(jìn)行藥物干預(yù)，Res組小鼠按照30 mg·kg-1·d-1的劑量給予SIRT1激活劑Res溶解于DMSO中，注射時(shí)0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液稀釋腹腔注射，溶劑對(duì)照組給予等量的DMSO 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液溶液腹腔注射，干預(yù)6周。

1.5 固體胃排空法檢測(cè)胃排空

干預(yù)6周后，所有小鼠禁食、不禁水20～24 h，給予小鼠已知量的食物，自由進(jìn)食3 h。3 h結(jié)束時(shí)，剩余食物稱(chēng)質(zhì)量，以確定食物攝入量。小鼠再次禁食禁水4 h。4 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出胃組織，測(cè)量整個(gè)胃的質(zhì)量，沿胃大彎剪開(kāi)胃組織，0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液清洗胃內(nèi)容物，濾紙吸干水分后測(cè)量胃凈重。胃排空率按以下公式計(jì)算：胃排空率(4 h內(nèi))=(1-胃內(nèi)殘留食物質(zhì)量/食物攝入量)×100%。

1.6 取材

將取出的胃組織沿胃小彎剪開(kāi)，取胃竇部位，一部分用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，另一部分，液氮速凍，于-80 ℃ 冰箱保存，用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋的胃竇組織切成6 μm切片，常規(guī)脫蠟再水化，按照二步法檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行染色，一抗為兔抗SIRT1多克隆抗體(1∶200)或兔抗Bach1多克隆抗體(1∶100)，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。DAB顯色后，封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。攝片后，用Image J軟件分析結(jié)果，測(cè)得積分吸光度值(integrated optical density，IOD)代表陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度，IOD=吸光度(A)×面積。

1.8 Western blotting檢測(cè)

將新鮮冷凍胃竇組織剪碎后加入裂解液RIPA與酶抑制劑PMSF，進(jìn)行勻漿(冰上進(jìn)行)，約5 min。將勻漿液在4 ℃下，12 000 r/min，離心15 min，收集上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度。等量蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)后，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移的PVDF膜上，用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA封閉2 h，加入一抗4 ℃ 孵育過(guò)夜。所用一抗如下：SIRT1抗體(1∶1 000)、Bach1抗體(1∶1 000)、HO-1抗體(1∶1 000)、c-kit抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶10 000)。次日TBST清洗后加入一抗種屬特異性二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，再次洗膜后用ECL顯像試劑盒顯影，置于凝膠成像儀中照相，并用Image J軟件分析條帶。

1.9 比色法檢測(cè)組織總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活力以及MDA含量

將新鮮組織勻漿(冰上進(jìn)行)后，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，取上清液分別按照SOD試劑盒和MDA試劑盒步驟測(cè)定胃組織中的T-SOD活力以及MDA含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況

空白組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，毛色亮澤，進(jìn)食飲水正常，對(duì)抓取抵抗明顯；模型組和溶劑對(duì)照組小鼠體型消瘦，食量減少，腹部脹滿，毛色干枯無(wú)光伴有脫毛，活動(dòng)遲緩，與空白組相比，體質(zhì)量明顯下降，血糖明顯升高(P<0.05)；Res組小鼠飲水及食量均增加，活動(dòng)性增強(qiáng)，一般情況較模型組和溶劑對(duì)照組有改善，體質(zhì)量及血糖與模型組和溶劑對(duì)照組小鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1、2)。

2.2 各組小鼠的胃排空率

與空白組相比，模型組和溶劑對(duì)照組小鼠的胃排空率明顯下降(P<0.05)；與模型組和溶劑對(duì)照組小鼠相比，Res組小鼠胃排空率明顯升高(P<0.05)；溶劑對(duì)照組與模型組小鼠間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表3。

表1 各組小鼠的體質(zhì)量變化

表2 各組小鼠隨機(jī)血糖濃度變化

表3 各組小鼠的胃排空率

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠胃竇組織中SIRT1、Bach1蛋白濃度

以細(xì)胞中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1和Bach1主要在胞核內(nèi)表達(dá)(圖1)。用Image J軟件分析免疫組織化學(xué)結(jié)果測(cè)得IOD值，與空白組小鼠相比，模型組和溶劑對(duì)照組小鼠胃組織中的SIRT1蛋白濃度明顯下降，Bach1蛋白濃度明顯升高(P<0.05)；與模型組和溶劑對(duì)照組小鼠相比，Res組小鼠胃組織中的SIRT1蛋白濃度明顯升高，Bach1蛋白濃度明顯下降(P<0.05)；模型組與溶劑對(duì)照組小鼠間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

圖1 各組小鼠胃竇組織SIRT1、Bach1表達(dá)Fig.1 Expression of SIRT1 and Bach1 in gastricantrum tissue of mice in each group(SP,40×)A: Blank group; B: Model group; C: Solvent control group; D: Res group; SIRT1: silent information regulator 1; IOD: integrated optical density； Res: resveratrol.

表4 SIRT1和Bach1在各組小鼠胃竇組織中的IOD值

2.4 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠胃竇組織中SIRT1、Bach1、c-kit以及HO-1蛋白濃度

Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠和溶劑對(duì)照組小鼠胃組織中的SIRT1、c-kit以及HO-1蛋白濃度明顯下降，Bach1蛋白濃度明顯升高(P<0.05)，與模型組和溶劑對(duì)照組相比，Res組小鼠胃組織中SIRT1、c-kit以及HO-1蛋白濃度明顯升高，Bach1蛋白濃度明顯下降(P<0.05)；模型組和溶劑對(duì)照組小鼠之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 各組小鼠胃竇組織SIRT1、Bach1、c-kit和HO-1濃度Fig.2 SIRT1, Bach1, c-kit and HO-1 protein levels in gastric antrum tissue of mice in each groupA: SIRT1 protein level; B: Bach1 protein level; C: c-kit protein level; D: HO-1 protein level; 1: Blank group; 2: Model group; 3: Solvent control group; 4: Res group; *P<0.05 vs Blank group, #P<0.05 vs Model group; Res: resveratrol; SIRT1： silent information regulator 1; HO-1: heme oxygenase-1; Res: resveratrol.

2.5 各組小鼠胃竇組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子MDA含量和T-SOD活力

與空白組小鼠相比，模型組和溶劑對(duì)照組小鼠胃組織中MDA含量明顯升高，T-SOD活力明顯下降(P<0.05)；與模型組和溶劑對(duì)照組小鼠比較，Res組小鼠胃組織中的MDA含量下降，T-SOD活力升高(P<0.05)；模型組小鼠與溶劑對(duì)照小鼠組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表5)。

表5 各組小鼠胃竇組織MDA含量和T-SOD活力

3 討論

氧化應(yīng)激是DGP發(fā)病的重要機(jī)制之一[4, 12]。持續(xù)的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的陰離子自由基，當(dāng)超過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時(shí)，就會(huì)在細(xì)胞線粒體內(nèi)積累，積累的自由基可以作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，從而引起組織損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，它會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。SOD是機(jī)體酶抗氧化系統(tǒng)的一員，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。持續(xù)的糖尿病高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化醛的產(chǎn)生增加，糖尿病相關(guān)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的器官功能損害是導(dǎo)致多種慢性合并癥的關(guān)鍵因素[3]，血清MDA濃度的升高與胃排空延遲密切相關(guān)[13]。ICC是胃慢波運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，對(duì)胃腸動(dòng)力的維持至關(guān)重要[14]。研究[4, 15]顯示，DGP的發(fā)病與氧化應(yīng)激所致的ICC減少有關(guān)。HO-1是機(jī)體重要的抵抗氧化應(yīng)激的防御因子之一，研究[4]顯示，在胃排空延遲的非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic mice，NOD)小鼠的胃組織中發(fā)現(xiàn)HO-1上調(diào)的消失以及ICC標(biāo)志物酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，c-kit)表達(dá)的減少，但是在胃排空正常的NOD小鼠中未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，施用HO-1誘導(dǎo)劑可以保護(hù)ICC網(wǎng)絡(luò)免受氧化應(yīng)激損傷，并使延遲的胃排空正?；痆4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了模型組小鼠胃排空延遲，且該組小鼠胃組織中HO-1上調(diào)的缺失同時(shí)伴隨著c-kit表達(dá)的減少，此外，本研究中胃排空延遲的小鼠胃組織中的MDA濃度明顯升高，且T-SOD活力顯著下降，氧化及抗氧化失衡，氧化應(yīng)激濃度升高。以上證據(jù)表明糖尿病小鼠胃組織中較高的氧化應(yīng)激濃度是ICC網(wǎng)絡(luò)損傷的重要原因之一，最終會(huì)導(dǎo)致糖尿病小鼠胃排空率的下降。

研究[16]顯示，SIRT1廣泛參與基因調(diào)節(jié)，基因組穩(wěn)定性維持，細(xì)胞凋亡、自噬、衰老、增生和腫瘤發(fā)生，主要通過(guò)使組蛋白和非組蛋白靶標(biāo)脫乙酰基，在組織穩(wěn)態(tài)和許多疾病的表觀遺傳調(diào)控中也具有關(guān)鍵作用。對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的研究[17-19]顯示，低濃度的SIRT1會(huì)加重氧化應(yīng)激損傷,而激活SIRT1可以減輕這種損傷：一項(xiàng)針對(duì)小鼠糖尿病心肌病的研究[20]顯示，SIRT1下調(diào)會(huì)使心肌細(xì)胞中PGC-1α和HO-1的濃度降低，心肌活性氧產(chǎn)生增加，導(dǎo)致糖尿病性心肌病；另外，上調(diào)SIRT1可以通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路減輕氧化應(yīng)激，來(lái)改善糖尿病腎病的缺血再灌注損傷[21]。由此可見(jiàn)，HO-1是SIRT1發(fā)揮抗氧化作用重要的下游因子之一。本研究中STZ誘導(dǎo)的DGP小鼠胃組織中SIRT1表達(dá)減少，進(jìn)一步導(dǎo)致HO-1上調(diào)的缺失，因此，SIRT1蛋白濃度的下調(diào)可能參與了DGP的發(fā)生與發(fā)展，但引起SIRT1下調(diào)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。相較模型組，給予SIRT1激活劑的糖尿病小鼠的胃排空率以及胃組織中的c-kit表達(dá)顯著升高，SIRT1及其下游因子HO-1的蛋白濃度也明顯升高，表明上調(diào)SIRT1可以保護(hù)糖尿病小鼠胃組織中的ICC網(wǎng)絡(luò)，并維持小鼠正常的胃排空，這與其上調(diào)HO-1有關(guān)；另外，與模型組小鼠相比，給予SIRT1激活劑的糖尿病小鼠胃組織中MDA含量明顯下降，T-SOD活力顯著升高，提示上調(diào)SIRT1還可以通過(guò)抑制組織中的過(guò)氧化反應(yīng)，并提高T-SOD活力來(lái)發(fā)揮抗氧化能力。

Bach1主要通過(guò)與小Maf癌蛋白形成異二聚體，并與小Maf識(shí)別元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合以抑制靶基因(包括編碼HO-1的基因)表達(dá)[22]。在缺乏Bach1的小鼠中，HO-1在許多組織中以較高濃度組成性表達(dá)，這表明Bach1在HO-1表達(dá)的負(fù)調(diào)控中起主要作用[23]。在高氧誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老模型中，Bach1蛋白表達(dá)明顯升高，一定程度上阻止了抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的核積累，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激濃度升高，從而加速細(xì)胞衰老[24]。另外一項(xiàng)針對(duì)肺纖維化小鼠的研究[25]發(fā)現(xiàn)，Bach1敲除后，抗氧化因子(如HO-1和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1)表達(dá)增加，肺泡和間質(zhì)細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)以及肺結(jié)構(gòu)的破壞顯著減弱。Bach1缺乏對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有預(yù)防作用，缺乏Bach1的小鼠可以使四氧嘧啶誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡減少，而這種保護(hù)作用的機(jī)制歸因于HO-1的上調(diào)[22]。以上證據(jù)表明，Bach1可能是組織細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其可以成為預(yù)防糖尿病及其相關(guān)性疾病的可能的治療靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃排空延遲的糖尿病小鼠胃組織中Bach1濃度升高，提示Bach1可能是DGP發(fā)病的關(guān)鍵因子。筆者假設(shè)DGP小鼠胃組織中SIRT1蛋白濃度下降可能是組織中Bach1高濃度的重要原因之一，本實(shí)驗(yàn)中給予SIRT1激活劑的小鼠胃組織中Bach1濃度較DGP小鼠相比明顯下降，HO-1表達(dá)顯著升高，因此，可以認(rèn)為SIRT1維持糖尿病小鼠正常胃排空的機(jī)制可能與其下調(diào)Bach1蛋白濃度，進(jìn)一步促進(jìn)抗氧化因子HO-1基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

此外，本研究給予Res干預(yù)可以改善DGP小鼠的胃排空延遲，但是并未使糖尿病小鼠的血糖濃度下降，這是否與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)以及激活劑劑量和療程有關(guān)尚未可知。在本實(shí)驗(yàn)條件下，上調(diào)SIRT1維持糖尿病小鼠正常的胃排空的作用不是通過(guò)影響血糖途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，上調(diào)SIRT1可以通過(guò)調(diào)控Bach1和HO-1濃度，保護(hù)DGP小鼠胃組織中的ICC網(wǎng)絡(luò)免受氧化損傷，并改善DGP小鼠胃排空延遲。此項(xiàng)研究為DGP患者的防治提供了新的理論依據(jù)。