寧婷婷 徐俊玄 劉 思 閔 力 朱圣韜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心 國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 消化疾病癌前病變北京市重點實驗室 北京消化中心，北京100050)

胃癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]，2018年胃癌發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第五位和第三位。根據(jù)國家癌癥中心最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)[2]，2015 年我國新發(fā)胃癌病例約40 萬，死亡病例約29 萬，分別位居我國惡性腫瘤的第二位和第三位。胃癌的發(fā)病原因復(fù)雜，在分子水平上進行機制研究，尤其是探索新的分子標志物與治療靶點，對于促進胃癌診療，提高患者的預(yù)后具有重要意義。

三結(jié)構(gòu)域蛋白(tripartite motif-containing protein，TRIM)家族成員廣泛、功能復(fù)雜，已被證實與細胞增生、DNA 損傷修復(fù)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫反應(yīng)等多種生理過程相關(guān)[3]。此外，TRIM家族蛋白參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，包括癌癥、炎性疾病、傳染性疾病、神經(jīng)精神疾病、染色體異常和發(fā)育性疾病等[4]。作為TRIM家族蛋白的一員，TRIM28可能參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道[5-8]，乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌以及非小細胞肺癌等惡性腫瘤中，TRIM28作為致癌因子，可通過多條信號通路促進腫瘤的侵襲和遷移。然而TRIM28在胃癌中的表達、侵襲遷移等生物學(xué)功能及其潛在分子機制尚不清楚。本研究擬分析TRIM28在胃癌組織和細胞中的表達情況以及TRIM28表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，并進一步通過細胞實驗探討TRIM28表達調(diào)控對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響及潛在的分子作用機制，以期為胃癌患者提供新的診斷生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIM28、β-catenin、c-Myc和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗購自美國Abcam 公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Trypsin)購自美國Gibco公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。超純水儀購自美國Millipore公司；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；無菌細胞培養(yǎng)瓶和細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；多功能酶標儀購自美國MD公司；TRIM28 siRNA購自中國吉瑪基因公司。

1.2 生物信息分析

從TCGA官方網(wǎng)站上下載胃癌患者的mRNA表達數(shù)據(jù)，分析比較胃癌患者與健康正常人中TRIM28的mRNA表達水平。同時利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析TRIM28表達水平與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

AGS人胃癌細胞株購自美國標準培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃含5%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)AGS細胞密度至50%～70%，應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑分別轉(zhuǎn)染control siRNA(健康對照組，NC組)以及TRIM28 siRNA(siTRIM28組)，依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。TRIM28 siRNA 購自蘇州吉瑪有限公司。si-TRIM28-1序列為5′-GGAGAUGAUCCCUACUCAA-3′，si-TRIM28-2序列為5′-GCGUGCAAGUGGACGUUAATT-3′，NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。

1.4 實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

細胞總RNA提取按Trizol說明書進行，TRIM28的RT-PCR檢測引物為5′-AAGGACCATACTGTGCGCTCTAC-3′(正向)與5′-ACGTTGCAATAGACAGTACGTTCAC-3′(反向)。GAPDH的qPCR檢測引物為5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(正向)與5′-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3′(反向)。

1.5 Transwell試驗

將不含血清的NC組和siTRIM28組的細胞懸液均勻接種在24孔板中，采用特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入750 μL含10%(體積分數(shù)) FBS的培養(yǎng)基，上室加入500 μL細胞懸液(無血清)，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出Chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min后DAPI 染色，觀察計數(shù)。

1.6 劃痕愈合試驗

將NC組和siTRIM28組的細胞以5×105的細胞濃度均勻接種在6孔板中，培養(yǎng)至細胞匯合。使用無菌移液管尖端在每個孔中進行劃痕處理。用無菌PBS進行洗滌以清除細胞碎片，然后在不含F(xiàn)BS的純培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在6 h的時間點，在每孔的相同位置拍攝記錄遷移狀態(tài)。

1.7 Western blotting

取NC組和siTRIM28組的細胞，用細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后煮沸變性10 min。每孔加樣蛋白約30 μg 左右，按參考文獻[9]進行操作，凝膠成像分析儀采集圖像并分析TRIM28、β-catenin和c-Myc蛋白。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

圖1 TRIM28在胃癌中的表達及與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.1 TRIM28 was highly expressed in gastric cancer and correlated with the outcome of patientsA: Analysis of TRIM28 in TCGA gastric RNA-seq data from 33 normal and 374 tumor samples (****P<0.000 1); B: Analysis of TRIM28 expression in GES-1 cell line and three gastric cancer cell lines (reference cell: GES-1, n=3); C-F: The relation of TRIM28 expression and overall survival of all (C), intestinal (D), diffuse (E), and mixed (F) gastric cancer; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2 結(jié)果

2.1 TRIM28在胃癌中的表達及與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.1.1 TRIM28在胃癌組織中的表達

基于TCGA胃癌轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，分析胃癌組織和正常胃組織中TRIM28的表達。結(jié)果(圖1A)顯示，胃癌組織中TRIM28 mRNA的相對表達量明顯高于正常胃組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。

2.1.2 qRT-PCR檢測TRIM28在胃癌細胞中的表達

利用qRT-PCR檢測本科室自存的胃癌細胞系(AGS、HGC-27和BGC-823)和永生化胃黏膜上皮細胞GES-1中TRIM28的表達情況。結(jié)果(圖1B)顯示，與永生化胃黏膜上皮細胞GES-1相比，TRIM28在3株胃癌細胞系中的表達上調(diào)。其中AGS細胞系中TRIM28表達水平最高。

圖2 敲低TRIM28對胃癌細胞的侵襲遷移能力的影響Fig.2 Silencing TRIM28 resulted in reduced invasion and migration properties of gastric cell line AGSA: The efficiency of TRIM28 knockdown in AGS cells (***P<0.001, n=3); B: Images of Transwell invasion test showed decreased invasion capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; C: Quantification of the Transwell invasion assay results (**P<0.01, n=3); D: Images of wound healing migration test showed decreased migration capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; E: Quantification of the wound healing migration assay results (*P<0.05, n=3); NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2.1.3 TRIM28與胃癌患者生存期的關(guān)系

為了進一步明確TRIM28表達與胃癌預(yù)后之間的關(guān)系，筆者利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的胃癌數(shù)據(jù)集進行在線生存分析。Meier Plotter數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：TRIM28表達水平對患者的總生存時間有顯著影響。與低表達組相比，TRIM28高表達組胃癌患者的總存活時間縮短(P=4E-16)(圖1C)；同樣TRIM28的表達水平對腸型胃癌患者(P=1.7E-11)(圖1D)和彌漫型胃癌患者(P=0.004 8)(圖1E)具有相同的影響；但是對于混合型胃癌(圖1F)，TRIM28表達水平與胃癌患者的預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P=0.37)。

2.2 敲低TRIM28對胃癌細胞的侵襲遷移能力的影響

2.2.1 siRNA敲低TRIM28基因的效率

為驗證si-TRIM28的基因敲低效率，以NC組及si-TRIM28-1 /si-TRIM28-2轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細胞提取總mRNA進行qRT-PCR實驗。結(jié)果(圖2A)顯示，在轉(zhuǎn)染處理后，與對照組相比，si-TRIM28處理組TRIM28的mRNA水平顯著下降，證明si-TRIM28效果可靠，為后續(xù)功能學(xué)實驗提供了保障。

2.2.2 TRIM28對胃癌細胞的侵襲能力的影響

利用Transwell試驗檢測TRIM28對AGS胃癌細胞侵襲能力的影響。結(jié)果(圖2B、C)顯示，TRIM28基因敲低后，侵襲細胞的數(shù)量顯著減少，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01,n=3)。

2.2.3 TRIM28對胃癌細胞的遷移能力的影響

利用劃痕愈合試驗檢測TRIM28對AGS胃癌細胞遷移能力的影響。結(jié)果(圖2D、E)顯示，TRIM28基因敲低后，AGS細胞的遷移能力明顯下降，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=3)。

2.3 TRIM28對Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

利用Western blotting試驗檢測TRIM28對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響。結(jié)果如圖3所示，TRIM28基因敲低后，β-catenin以及下游靶基因c-Myc的蛋白表達水平明顯下降。這些結(jié)果表明，TRIM28能夠激活Wnt/β-catenin信號通路。

圖3 干擾TRIM28后c-Myc和β-catenin的表達下調(diào)Fig.3 Western blotting showed downregulation of c-Myc and β-catenin in AGS cells with knockdown of TRIM28NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

3 討論

TRIM家族在結(jié)構(gòu)上高度保守，從N端到C端的順序依次為鋅-指結(jié)構(gòu)(RING box)、1個或2個B-box結(jié)構(gòu)域和1個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。TRIM家族涉及多種生物學(xué)過程，如細胞凋亡、細胞分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生等[3]。近年來，TRIM家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注[3]。研究[10-12]表明，多種TRIM家族成員在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。作為TRIM家族中重要的一員，TRIM28在腫瘤中的作用日益受到重視[5-6, 13-15]。然而，TRIM28在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制目前尚未有報道。

在本研究中，筆者通過生物信息學(xué)分析和體外實驗來研究TRIM28在胃癌中的表達和功能及其分子機制。結(jié)果顯示，胃癌組織和細胞株中TRIM28表達水平均明顯上調(diào)，而且TRIM28的異常高表達與胃癌患者預(yù)后差有關(guān)；這說明TRIM28與胃癌緊密相關(guān)，并有作為診斷胃癌的生物標志物的潛力。此外，本研究體外功能學(xué)實驗結(jié)果表明，干擾TRIM28可以抑制胃癌細胞侵襲和遷移?？傮w而言，本研究結(jié)果證明TRIM28可以促進胃癌細胞的侵襲和遷移。

TRIM家族蛋白作為致癌因子，可以通過Wnt信號通路在細胞增生、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且主要是通過Wnt/β-catenin信號通路。TRIM59通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號通路，進而促進神經(jīng)母細胞瘤的增生[16]；甲狀腺癌中，干擾TRIM44可以下調(diào)β-catenin及其下游靶基因cyclin-D1和c-Myc的表達，進而抑制甲狀腺癌細胞的增生、侵襲、遷移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化[17]；在肝細胞癌中，TRIM66通過促進β-catenin降解復(fù)合物中的GSK-3β磷酸化，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展[18]；在卵巢癌中，干擾TRIM28可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的β-catenin、支架蛋白(Axin)、T細胞因子1(T-cell factor 1, TCF1)和淋系增強子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1, LEF1)，進而抑制卵巢癌細胞侵襲、遷移和上皮間葉轉(zhuǎn)化等[13]。筆者猜測，在胃癌中TRIM28也可能參與對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控。本研究進一步采用Western boltting法檢測β-catenin和下游靶基因c-myc的表達情況，結(jié)果顯示，在胃癌中TRIM28能夠活化Wnt/β-catenin 信號通路。

綜上所述，本研究顯示，胃癌組織和細胞株中TRIM28高表達，而且TRIM28高表達的胃癌患者預(yù)后相對較差。TRIM28在胃癌進展過程中作為癌基因發(fā)揮作用，并可能通過Wnt/β-catenin 信號通路促進胃癌細胞的侵襲和遷移。今后進一步深入研究TRIM28將有望為治療胃癌提供新的有效的治療靶點。值得注意的是，異常表達的TRIM28能否成為診斷胃癌的生物標志物，需要檢測更多樣本，同時還應(yīng)檢測患者和正常人群血液中TRIM28的表達情況。