張媛媛，周 錦，曹惠鵑，張鐵錚，孫瑩杰

0 引言

體外循環(huán)(CPB)是與心血管外科手術(shù)相關(guān)的主要技術(shù)，該技術(shù)可提高許多心臟病的治愈率。然而，血液與CPB設(shè)備內(nèi)表面的接觸，可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，刺激促炎因子釋放，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成傷害。目前，CPB后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥已成為關(guān)注的焦點(diǎn)，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，炎癥性腦損害是其中一個(gè)方向[1-2]，而能有效預(yù)防CPB后神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物和介入手段仍比較有限。既往研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答是通過(guò)TLR4完成的，TLR4是觸發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[3]。右美托咪定是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮以及輕度鎮(zhèn)痛作用，能夠減輕炎性反應(yīng)，具有獨(dú)特的器官保護(hù)作用[4-5]。因此，本研究通過(guò)建立大鼠無(wú)血預(yù)充體外循環(huán)模型，觀察右美托咪定對(duì)體外循環(huán)大鼠血清和海馬區(qū)腦組織炎性因子水平、海馬區(qū)腦組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)的影響，探討右美托咪定對(duì)體外循環(huán)致大鼠腦損傷的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年雄性SD大鼠30只，2～3月齡，350～400 g，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，且經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)核準(zhǔn)通過(guò)。大鼠在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前6 h禁食，自由飲水。30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組10只，假手術(shù)組(Sham組)：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，行氣管插管，右頸內(nèi)靜脈、右股靜脈、左股動(dòng)脈及尾動(dòng)脈穿刺置管，不進(jìn)行體外循環(huán)。體外循環(huán)組(CPB組)：同Sham組氣管插管和動(dòng)靜脈置管后，行CPB 1 h。右美托咪定+CPB組(DC組)：大鼠CPB前15 min內(nèi)經(jīng)靜脈泵注右美托咪定5 μg/kg，然后在CPB過(guò)程中以5 μg/(kg·h)的速度泵注1 h，其余同CPB組。設(shè)定4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：T1 (CPB前)、T2(轉(zhuǎn)流1 h)、T3(轉(zhuǎn)流后2 h)、T4(轉(zhuǎn)流后6 h)。

根據(jù)孩子的好勝心理，可以舉行各式各樣的比賽。教師要積極創(chuàng)設(shè)條件，讓學(xué)生參與到課堂學(xué)習(xí)的各種比賽之中，這樣，學(xué)生學(xué)得快樂(lè)，學(xué)得高效。如教師指導(dǎo)學(xué)生朗讀課文時(shí)，可以采用個(gè)人賽讀、小組賽讀、男女賽讀等形式，比比誰(shuí)讀得有感情。

1.2 建立大鼠CPB模型 本研究依照Chen等[6]的模型制備方法，建立無(wú)血預(yù)充大鼠體外循環(huán)非停跳模型。

作者的回復(fù)——我們感謝P.Molnar對(duì)我們工作（Parker et al，2011）的興趣，并客氣地（相當(dāng)正確地）指出地殼均衡在龍門山造山帶長(zhǎng)期物質(zhì)方量平衡中的潛在作用。然而，他的觀點(diǎn)并沒(méi)有影響我們的文章的主要思想，即評(píng)估與地震相關(guān)的侵蝕過(guò)程與構(gòu)造過(guò)程之間的瞬時(shí)競(jìng)爭(zhēng)。而地殼均衡又是另一個(gè)原因，除了前面我們提出的，為什么我們描述的這種瞬時(shí)不平衡可能不會(huì)保持長(zhǎng)的時(shí)間尺度，即超過(guò)多個(gè)地震周期和黏彈性響應(yīng)時(shí)間（＞1 000年）。確實(shí)，我們?cè)谖覀兊奈恼轮刑岢?，長(zhǎng)期的巖石抬升不可能是2008年同震位移的簡(jiǎn)單函數(shù)；它是由構(gòu)造活動(dòng)與彎曲均衡變形的組合產(chǎn)生的，但每個(gè)分量的相對(duì)重要性并不是我們研究的重點(diǎn)。

1.3 標(biāo)本采集與處理 每組按時(shí)間點(diǎn)經(jīng)保留的右股靜脈采血0.5 ml，室溫下靜置，10 min后離心(3 000 r/min，10 min)。留取上層血清保存在-20 ℃深低溫冰柜中，供ELISA檢測(cè)用。將大鼠放置于較大的托盤內(nèi)，全麻狀態(tài)下剪開胸骨，快速且完整分離胸腺，充分顯露心臟。經(jīng)左心室穿刺置管并連接300～400 ml冰鹽水灌注，同時(shí)在大鼠右心耳處剪一創(chuàng)口，起初有紅色血液流出，待流出液轉(zhuǎn)為無(wú)色液體時(shí)，斷頭取腦。兩側(cè)均由枕骨大孔至眼眶剪開，掀開顱頂骨，剪斷顱底部視神經(jīng)，游離全腦并置于備好的冰袋上，迅速分離海馬組織，置于凍存管中，保存在-80 ℃冰箱里，ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α水平，Western blot檢測(cè)TLR4、NF-kB蛋白表達(dá)。

大鼠稱重后，以300 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠無(wú)翻轉(zhuǎn)反射后固定于鼠板上，采用透光法進(jìn)行氣管內(nèi)插管(16G套管針)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)定參數(shù)。呼吸參數(shù)：FiO2=1.0，TV 3 ml/100 g，f=60/min，吸呼比1∶1.5，氣道峰壓9 cmH2O。穿刺部位剃毛，碘伏消毒，右股靜脈處穿刺置管(22G)并連接液體進(jìn)行補(bǔ)液；尾動(dòng)脈穿刺(24G)并連接一次性壓力傳感器測(cè)量有創(chuàng)動(dòng)脈血壓；右頸內(nèi)靜脈穿刺，并將導(dǎo)管尖端置于心房(18G，多側(cè)孔以便引流)；左股動(dòng)脈置管(22G)用于CPB過(guò)程中血液回輸。大鼠靜脈注射400 IU/kg肝素鈉，活化凝血時(shí)間達(dá)到400～450 s時(shí)，開始CPB。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血預(yù)充方法制備CPB模型，因此需配置15 ml緩沖液填充CPB管路。成分：6%羥乙基淀粉12 ml、20%甘露醇1 ml、5%NaHCO32 ml和肝素鈉150 IU/kg。全部CPB系統(tǒng)由以下各部分組成：連接頸內(nèi)靜脈處的血液輸出管、容量為10 ml的儲(chǔ)血槽、恒流蠕動(dòng)泵、用于氣體交換的膜式氧合器、連接尾動(dòng)脈的輸入端。儲(chǔ)血器固定于低于大鼠心臟平面40 cm的位置，以便達(dá)到理想的引流量。將新配制的15 ml緩沖液緩慢加至CPB管路中，排空氣泡。打開引流管處的開關(guān)，將血液從心房引流至儲(chǔ)血器中，起初轉(zhuǎn)流量為25～30 ml/(kg·min)，緩慢增加達(dá)到100～150 ml/(kg·min)，此時(shí)儲(chǔ)血器中血液平面維持在3～4 ml為宜。CPB開始后將氧氣接口與膜肺相連，關(guān)閉小動(dòng)物呼吸機(jī)。轉(zhuǎn)流期間，依照血?dú)夥治鼋Y(jié)果調(diào)整用藥，使之達(dá)到MAP>60 mmHg、pH值7.35～7.45、PaCO235～45 mmHg、堿剩余(BE)-3～3 mmol/L的穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)流達(dá)到1 h后，緩慢減小轉(zhuǎn)流量直至停止，啟動(dòng)呼吸機(jī)，重新恢復(fù)機(jī)械通氣。保留右股靜脈及尾動(dòng)脈的套管針，以便輸液和測(cè)量血壓。其余管道拔除并結(jié)扎血管，縫合切口。嚴(yán)密監(jiān)測(cè)大鼠生命體征，必要時(shí)回輸管路中血液，應(yīng)用多巴胺等維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)流過(guò)程中，根據(jù)足底反射反應(yīng)適量追加水合氯醛100 mg/kg。

從回歸方程中，可以看出中國(guó)乳制品的進(jìn)口需求價(jià)格彈性系數(shù)為0.585，需求的價(jià)格彈性小于1，需求缺乏彈性。這說(shuō)明在其他條件不變的情況下，根據(jù)需求的彈性理論，即中國(guó)乳制品的價(jià)格每上升1%，則相應(yīng)的乳制品進(jìn)口量就下降0.585%。由此可以看出，中國(guó)乳制品進(jìn)口的價(jià)格對(duì)乳制品的進(jìn)口量雖然有一定影響，但影響程度不大，即價(jià)格因素并不是影響乳制品進(jìn)口的關(guān)鍵因素，進(jìn)口乳制品在中國(guó)已經(jīng)占據(jù)較為穩(wěn)定的市場(chǎng)。

2 結(jié)果

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α濃度比較 T2～T4時(shí)，CPB組和DC組大鼠血清中IL-6、TNF-α濃度高于Sham組(P<0.05)，DC組大鼠血清中IL-6、TNF-α濃度低于CPB組(P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

2.1 各組大鼠血清S100-β濃度比較 T2～T4時(shí)，CPB組和DC組大鼠血清中S100-β濃度高于Sham組(P<0.05)，DC組大鼠血清中S100-β濃度低于CPB組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

右美托咪定作用于藍(lán)斑核神經(jīng)元的α2AR，抑制神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)生，阻斷興奮向下游傳導(dǎo)，發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用；通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，明顯減輕脊髓損傷后的組織損傷并改善神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)局[7-9]；通過(guò)抗氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，能夠明顯減輕糖尿病大鼠短暫的全腦缺血再灌注損傷[10]。

傳統(tǒng)的鉆井施工經(jīng)驗(yàn)及模式在施工中根深蒂固，抓住“三個(gè)一”精準(zhǔn)化鉆井施工模式這一關(guān)鍵，推動(dòng)“五個(gè)轉(zhuǎn)變”，實(shí)現(xiàn)鉆井工作的高端化。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)腦組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)比較 與Sham組比較，CPB組和DC組海馬區(qū)腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與CPB組比較，DC組海馬區(qū)腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1～圖4。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清S100-β濃度比較(pg/ml)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6濃度比較(pg/ml)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α濃度比較(ng/ml)

表4 各組大鼠海馬區(qū)腦組織IL-6、TNF-α濃度比較

圖1 各組大鼠海馬區(qū)TLR4蛋白表達(dá)情況

圖2 各組大鼠海馬區(qū)TLR4蛋白表達(dá)情況

圖3 各組大鼠海馬區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)情況

3 討論

2.3 各組大鼠海馬區(qū)腦組織IL-6、TNF-α水平比較 CPB組、DC組海馬區(qū)腦組織IL-6、TNF-α水平高于Sham組(P<0.05)，DC組海馬區(qū)腦組織IL-6、TNF-α水平低于CPB組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

圖4 各組大鼠海馬區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)情況

S100-β作為腦損傷標(biāo)志物具有高度特異性，對(duì)評(píng)定早期腦損害有重要價(jià)值。Kanbak等[11]對(duì)CPB下行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)患者研究發(fā)現(xiàn)，CPB能明顯增加患者血清中S100-β濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，CPB開始便可觸發(fā)腦內(nèi)S100-β釋放入血，隨著時(shí)間發(fā)展有明顯上升趨勢(shì)，右美托咪定可顯著降低血中S100-β水平，減輕CPB致腦損傷。

TLR4是最先被人類研究發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體家族蛋白[12]，廣泛存在于人類各器官免疫系統(tǒng)中。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，雖然兩種膠質(zhì)細(xì)胞均有TLR4表達(dá)，但是僅小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體與配體結(jié)合才能觸發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子[13]。除參與炎癥反應(yīng)外，TLR4還介導(dǎo)多個(gè)重要器官的缺血再灌注損傷[14]。

體外循環(huán)腦損傷機(jī)制尚未明確，主要研究熱點(diǎn)集中于炎癥和缺血再灌注損傷。在整個(gè)腦缺血再灌注損傷病程中，腦內(nèi)防御細(xì)胞，如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等釋放大量熱休克蛋白、β淀粉樣蛋白、透明質(zhì)酸等作用于小膠質(zhì)細(xì)胞表面并與TLR4結(jié)合，進(jìn)一步激活TLR4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生炎性物質(zhì)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。Hyakkoku等[15]的研究指出，大腦中動(dòng)脈閉塞120 min，恢復(fù)血供1 d后，相比野生型小鼠，TLR4無(wú)功能性突變鼠的腦梗死范圍明顯減小，同時(shí)，缺血再灌注后的神經(jīng)損害得到改善。此外，缺血再灌注后TLR4無(wú)功能性突變鼠的NF-κB p65亞基明顯減少，證明TLR4基因敲除在小鼠缺血再灌注模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另外，研究大鼠局灶性缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，針刺足三里穴位能夠有效對(duì)抗缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)，減少TLR4/NF-κB通路下游TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生[14]，由此證明TLR4和NF-κB通路參與腦組織缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展。本研究表明，體外循環(huán)后海馬區(qū)腦組織TNF-α和 IL-6水平、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加，CPB前和CPB過(guò)程中靜脈輸注右美托咪定能有效下調(diào)海馬區(qū)腦組織TNF-α和 IL-6水平、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)。有研究在大鼠敗血癥模型中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用α2AR拮抗劑阿替美唑可對(duì)抗右美托咪定下調(diào)TLR4的作用[16]。因此，我們推測(cè)腦內(nèi)右美托咪定下調(diào)TLR4和NF-κB的機(jī)制也可能與其激活α2腎上腺素受體有關(guān)。該推測(cè)有待后續(xù)研究給予證實(shí)。

綜上所述，右美托咪啶通過(guò)抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少其下游IL-6、TNF-α水平和NF-κB蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。