劉魏然，王宇喆，韓天壯，陳志忠，錢 亭，尹化斌

0 引言

肝癌是嚴重危害人類健康的主要疾病之一[1]，由于肝癌發(fā)病隱匿，絕大多數患者確診時已處于中晚期，失去了最佳的手術機會，需要進行以化療為主或為輔的綜合治療。目前常用的化療藥物包括蒽環(huán)類、氟尿嘧啶及順鉑類等，但由于其毒副反應大，患者的耐受性及敏感性差，因此尋找一種有效的化療藥物成為熱點。

組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor，HDACi)作為一種新的化療藥物，可以抑制組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)的活性，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出了強大的作用[2]。表觀遺傳學藥物FK228是一類由紫色色素桿菌產生、主要分布在細胞核內、結構獨特、高效、低毒、作用廣譜的雙環(huán)Ⅰ類HDACi[3]。目前,FK228已經被美國FDA 批準用于治療外周及皮膚T-細胞淋巴瘤。為此，我們研究了FK228對人肝癌細胞HepG2體內外抑制作用，并初步探討其作用機制，為臨床治療肝癌提供實驗和理論依據。

1 材料與試藥

1.1 實驗動物和細胞系 BALB/c裸鼠，4～5周齡，均為雄性，體重約14～16 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海國睿生命科技有限公司。人肝癌細胞HepG2購自中國科學院干細胞庫。

1.2 主要試劑 DMEN培養(yǎng)基為美國Sigma公司生產，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為美國Gibco公司產品，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑為美國BD公司產品，CCK-8試劑盒和Matrigel基質膠均購于上海勵韜生物科技有限公司，F(xiàn)K228購于上海陶素生化科技有限公司，5-FU購于上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。

2.2 細胞增殖檢測及藥物的半數抑制濃度測定 取對數生長期的HepG2細胞，以5×103個/100 μl接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實驗分為4組，F(xiàn)K228組、5-FU組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)。FK228組設1.25、2.5、5、10、20、40 μg/L 6個濃度梯度，5-FU組設6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml 6個濃度梯度，聯(lián)合組取5 μg/L的FK228和25 μg/ml的5-FU共同作用細胞，每個濃度設3個復孔。加藥后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后向每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。細胞生長抑制率=(Ac-As)/(Ac-Ab)×100%，細胞存活率=1-細胞抑制率，其中Ac表示對照孔的吸光度值，As表示實驗孔的吸光度值，Ab表示空白孔的吸光度值，實驗重復3次。

2.3 細胞凋亡檢測 取對數生長的HepG2細胞，用胰酶消化后吹打成細胞懸液，以每孔5×105個細胞接種于六孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實驗分4組：FK228組、5-FU組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，加藥后，將六孔板放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞及細胞培養(yǎng)液。用遇冷的PBS洗滌2遍后，重懸細胞于Binding Buffer中，加入 FITC Annexin V 5 μl和PI 5 μl后，常溫下避光作用15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

2.4 HepG2細胞荷瘤鼠模型的建立 5周齡左右的BALB/c裸鼠于右側腋窩皮下接種含Matrigel基質膠的HepG2細胞混懸液(0.2 ml/只，5×107個HepG2細胞/ml)。待瘤塊長至一定大小后，處死荷瘤裸鼠。無菌條件下取出荷瘤鼠瘤塊，于無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffered saline，PBS)中剪成1～2 mm3小塊，再接種于20只裸鼠腋窩皮下，觀察接種情況。

2.5 體內抑制實驗 待腫瘤體積長至100～150 mm3后，將成瘤的20只裸鼠隨機分成4組，即對照組、5-FU組、FK228組、聯(lián)合組，每組5只。分組當天即給藥，5-FU組的給藥量為20 mg/kg，F(xiàn)K228組的給藥量為1 mg/kg，對照組給等量的含溶劑的生理鹽水，分別于第1、4、8、11天給藥；聯(lián)合組給藥量按照FK228和5-FU單藥組的劑量和頻率進行給藥。給藥周期為21 d，每隔5 d用游標卡尺測量腫瘤大小，并計算腫瘤體積V=ab2/2，其中a表示腫瘤的長徑，b表示腫瘤的短徑。

2.6 免疫組化染色 21 d后處死裸鼠，立即取出裸鼠的腫瘤組織，用10%福爾馬林溶液進行固定。將固定好的腫瘤組織進行脫水、包埋成石蠟組織塊，將其制成切片后根據實驗步驟進行caspase 3凋亡染色和CD31血管染色。凋亡的腫瘤細胞的胞質會被染成棕黃色，每組內每張切片隨機挑選200倍視野進行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，并且保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取照片中相同的棕黃色作為判斷陽性結果的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析，得出陽性的累積光密度(Integrated optical density，IOD)值。CD31表達于血管內皮，腫瘤內的血管內皮細胞內會出現(xiàn)棕黃色顆粒。腫瘤的微血管密度(Micro-vessel density，MVD)分析參照Weidner 等校對計數方法，先在低倍光鏡下掃查整個切片，尋找3個血管高密度區(qū)，即“熱點”；然后在200倍光鏡下計數3個視野的血管數目平均值作為MVD值。

2.7 統(tǒng)計學方法 所有數據均采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件與Graphpad 6.0分析軟件進行分析，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 單獨應用FK228與5-FU和兩藥聯(lián)合應用對肝癌細胞HepG2生長的影響 FK228與5-FU對肝癌細胞HepG2均有明顯的生長抑制作用，且均呈劑量依賴性。見圖1。FK228的半數抑制濃度(IC50)為(4.20±0.24)μg/L；5-FU的IC50值為(117.50±8.40)μg/ml，表面FK228在極低濃度對HepG2就有較強的殺傷力。將濃度為5 μg/L的FK228和25 μg/ml的5-FU聯(lián)合作用于細胞48 h，結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228可以抑制細胞活性，且與單藥組相比，聯(lián)合用藥組的細胞存活率明顯減低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖1 FK228與5-FU對肝癌細胞HepG2的抑制作用

圖2 FK228和5-FU單用與聯(lián)合應用對肝癌細胞HepG2的生長活性影響

3.2 FK228與5-FU聯(lián)合應用促進肝癌細胞HepG2的凋亡 流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228、5-FU單獨作用均可顯著誘導肝癌細胞HepG2的凋亡，且聯(lián)合用藥后細胞的總體凋亡率較單藥組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而FK228與5-FU相比，兩藥對肝癌細胞HepG的體外促凋亡作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3、圖4。

圖3 采用PI/Annexin V雙染法檢測肝癌細胞HepG2凋亡的流式結果

圖4 采用PI/Annexin V雙染法檢測肝癌細胞HepG2凋亡的流式結果

3.3 FK228對裸鼠皮下HepG2移植瘤的生長抑制作用 各組腫瘤治療后的體積變化如圖5所示，在治療后的第21天，F(xiàn)K228組、5-FU組、聯(lián)合給藥組及對照組的腫瘤體積分別為(344.71±118.87)、(351.97±73.46)、(220.36±72.12)、(639.76±241.47) mm3。FK228組、5-FU組、聯(lián)合給藥組的裸鼠腫瘤體積均小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。表明經FK228的治療，裸鼠腫瘤的增長減慢，且聯(lián)合用藥后對裸鼠腫瘤的生長抑制作用更加明顯。

圖5 各治療組的裸鼠皮下肝癌體積隨時間變化曲線

3.4 FK228和5-FU聯(lián)合給藥促進肝癌細胞HepG2的體內凋亡及抑制腫瘤的血管生成 免疫組化結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228對肝癌細胞HepG2的體內促凋亡作用并不明顯(P>0.05)，但與5-FU聯(lián)合應用后，促凋亡作用較單獨用藥組明顯增強(P<0.05)。與對照組相比，F(xiàn)K228可以明顯抑制腫瘤內的血管生成(P<0.05)；5-FU單獨使用時，其MVD值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，與FK228聯(lián)合后，可以明顯抑制腫瘤內的血管生成。表明FK228與5-FU聯(lián)合用藥后，可能通過促進肝癌細胞HepG2的凋亡及抑制腫瘤的血管生成，從而抑制裸鼠皮下移植瘤的生長。見圖6、圖7。

4 討論

FK228因其特殊的縮酯環(huán)肽結構，可有效透過細胞膜，通過抑制組蛋白去乙酰化酶抑制劑而發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管目前FK228僅被批準用于淋巴瘤的治療，但對其他人癌細胞系的體外實驗和對人瘤嫁接物及鼠瘤的體內實驗中，F(xiàn)K228均顯示了良好的抗腫瘤活性[4]。FK228的體外抗腫瘤作用極其顯著(IC50在納克水平)，研究已證明，F(xiàn)K228對多種腫瘤細胞如肺癌、肝癌、腎細胞癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等作用效果良好[5-10]。

圖6 各組腫瘤組織的caspase-3染色結果(200×)

圖7 各治療組腫瘤組織的CD31染色結果(200×)

本實驗通過CCK-8法證明了FK228與5-FU可以體外抑制肝癌細胞HepG2的增殖，呈劑量依賴性，且聯(lián)合用藥后細胞的生長抑制率明顯增加；5-FU對HepG2細胞48 h的IC50分別為(117.50±8.40)μg/ml，而FK228的IC50值為(4.20±0.24)μg/L。通過構建裸鼠皮下移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K228具有較強的體內抑制HepG2移植瘤生長的作用，且與5-FU聯(lián)合應用抑制作用明顯增加。

目前，HDACi發(fā)揮抗腫瘤的確切作用機制尚不明確，研究者普遍認為HDACi通過抑制HDACs的活性，可以引起染色質重塑和基因表達的改變，從而發(fā)揮不同的生物學效應，其中的一個重要機制就是引起腫瘤細胞的凋亡[11-12]。研究表明，F(xiàn)K228可以引起多種腫瘤細胞的凋亡，特別是與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥時[13-15]。Valdez等[15]將FK228與氟達拉濱、氯法拉濱、白消安聯(lián)合作用于淋巴瘤患者的PEER和SUPT1細胞時，發(fā)現(xiàn)與其他任何單藥、兩藥或三藥聯(lián)合相比，增加了FK228的四藥聯(lián)合，可通過引起組蛋白修飾、DNA損傷、降低谷胱甘肽的水平、增加活性氧產物的水平、下調藥物的轉運蛋白MRP1的表達及抑制多種生存信號途徑，從而對惡性T細胞表現(xiàn)出更加明顯的促進凋亡和抑制生長作用。本研究分別通過體內、外實驗證明了FK228可以引起肝癌細胞HepG2的凋亡，與5-FU聯(lián)合應用后，對肝癌細胞的體、內外促凋亡作用明顯增強，但對促凋亡的機制并未進行深入研究。Sun等[16-20]研究表明，F(xiàn)K228可以通過激活Erk/MAPK途徑和JNK/MAPK途徑引起肝癌細胞的凋亡，且呈時間和濃度依賴性。越來越多的研究表明，HDACi可以通過降低血管內皮生長因子(VEGF)的表達和提高宿主免疫功能而抑制腫瘤的血管生成，但目前仍不能確定這些生物學效應對HDACi抗腫瘤是否起到關鍵的作用。本研究也證實了與對照組和5-FU組相比，F(xiàn)K228可以抑制裸鼠皮下HepG2肝癌內的血管生成，但是對FK228是通過何種作用機制引起腫瘤內的血管生成減少并未進行深入研究，也不能確定抑制腫瘤的血管生成是否對FK228抗腫瘤起到關鍵的作用，因此仍需進一步的探討。除此之外，F(xiàn)K228還可以通過阻滯細胞周期、誘導細胞分化、促進自體吞噬等，進一步達到抗腫瘤的目的[21]。

總之，F(xiàn)K228與5-FU聯(lián)用一方面通過不同作用機制藥物的聯(lián)合提高肝癌對5-FU的敏感性，另一方面在保證療效的前提下，減少5-FU的用量，從而降低其毒副作用。本研究僅初步探討了FK228和5-FU聯(lián)合應用對肝癌細胞HepG2的體內、外抑制作用，對兩藥聯(lián)合的不同形式、兩藥聯(lián)合最適合的劑量比及兩藥聯(lián)用的具體作用機制等還有待于進一步研究。