王 顥 譚玉杰

鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院，河南省洛陽(yáng)市 471009

CD47是免疫球蛋白超家族的一員，普遍存在于人類(lèi)細(xì)胞膜表面。人們發(fā)現(xiàn)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α可識(shí)別并結(jié)合巨噬細(xì)胞表面跨膜CD47糖蛋白，參與調(diào)節(jié)免疫識(shí)別、細(xì)胞黏附、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞存活等途徑，是誘導(dǎo)免疫耐受的重要調(diào)節(jié)分子[1]。因此在流產(chǎn)保胎治療靶點(diǎn)干預(yù)研究上該因子逐漸成為探索的重點(diǎn)，但目前具體機(jī)制尚不明確。STOX1基因定位于人類(lèi)10號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶1亞帶上，是該染色體上的特有的基因開(kāi)放閱讀框。在子癇前期的研究中發(fā)現(xiàn)其為與該病有密切關(guān)聯(lián)的印跡基因，并認(rèn)識(shí)到絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞上的STOX1基因可通過(guò)干預(yù)絨毛侵襲，對(duì)胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育起很重要影響[2]。

目前人們?cè)贑D47對(duì)STOX1干預(yù)及二者與絨毛發(fā)育的相關(guān)性認(rèn)識(shí)上尚不明確。因此本研究擬通過(guò)開(kāi)展對(duì)CD47干預(yù)不同階段絨毛STOX1的表達(dá)并觀察此兩者與絨毛的發(fā)育的相關(guān)性，初步了解它們?cè)谧甜B(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程中的相互影響，為流產(chǎn)保胎的靶向免疫治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組：選擇2017年3月—2019年5月在我院婦產(chǎn)科就診的因非意愿妊娠要求人工流產(chǎn)的健康婦女，將其分為早孕1組(妊娠5～7+6周，30例)，早孕2組(妊娠8～11周，30例)。

1.1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn)：兩組年齡設(shè)定20～40歲。所選病例均為胎兒發(fā)育正常，并經(jīng)染色體核型分析鑒定。同時(shí)排除妊娠合并癥和并發(fā)癥。

1.2 方法及觀察指標(biāo)

1.2.1 絨毛細(xì)胞培養(yǎng)和染色體鑒別：人流吸宮術(shù)獲取無(wú)菌絨毛組織，取大約20mg絨毛，生理鹽水反復(fù)清洗，拉碎后加入由0.25%胰蛋白酶充分消化，離心(2 000r/min，10min)去上清，收集細(xì)胞均勻接種，加入絨毛細(xì)胞培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)傳代細(xì)胞形成小克隆后即可收獲細(xì)胞進(jìn)行G顯帶制片分析絨毛染色體。

1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染CD47：倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶瓶壁細(xì)胞鋪滿約90%即可傳代。棄舊液，加入0.25%胰蛋白酶消化后，倒掉消化液，加入新培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，每瓶細(xì)胞傳三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。將攜帶CD47基因的慢病毒質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組絨毛細(xì)胞。然后用蛋白免疫印跡法檢測(cè)慢病毒CD47基因細(xì)胞株中蛋白的表達(dá)量，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)(流式細(xì)胞法)：提前1d將CD47干預(yù)前后各組絨毛細(xì)胞置入6孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d后，胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS沖洗，離心(1 000r/min，5min)，收集細(xì)胞沉淀。加入緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITc混勻后，避光室溫孵育15min，加入5μl PI標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析各組絨毛細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)STOX1 mRNA的表達(dá)：提取各組的絨毛細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到特異性cDNA，目的片段長(zhǎng)度195bp。隨即行real time PCR試驗(yàn)。計(jì)算STOX1mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

收獲的絨毛細(xì)胞行G顯帶分析染色體核型分析提示均為正常健康人類(lèi)染色體，未見(jiàn)明顯數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，其中32例46，XY；28例46，XX。絨毛細(xì)胞凋亡率隨著孕周增加逐漸降低，且經(jīng)CD47干預(yù)的絨毛細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染時(shí)凋亡率明顯降低(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。STOX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各組絨毛組織間存在差異(P<0.05)，未干預(yù)前早孕1組表達(dá)相對(duì)較低，隨著孕周進(jìn)展早孕2組表達(dá)相應(yīng)增高。CD47干預(yù)后各組STOX1 mRNA表達(dá)仍呈現(xiàn)為隨著孕周的增加而上升，且相對(duì)干預(yù)前各對(duì)應(yīng)組明顯升高(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表1 CD47干預(yù)前后各組絨毛細(xì)胞凋亡率比較

表2 CD47干預(yù)前后各組 STOX1 mRNA表達(dá)情況比較

3 討論

流產(chǎn)的病因復(fù)雜，嚴(yán)重危害育齡婦女生殖健康，其發(fā)病機(jī)制及治療是目前婦產(chǎn)科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。對(duì)流產(chǎn)機(jī)制中母體免疫耐受與細(xì)胞凋亡調(diào)控方面的探索近幾年有突飛猛進(jìn)的發(fā)展[3-4]。

人們認(rèn)識(shí)到惡性腫瘤細(xì)胞表面CD47表達(dá)異常增高，當(dāng)它與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α識(shí)別后通過(guò)磷酸化途徑激發(fā)，大大降低巨噬細(xì)胞殺傷清理異常細(xì)胞的功能，形成免疫耐受，其與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[1，5]。在探索白血病發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)白血病干細(xì)胞表面的CD47在激發(fā)細(xì)胞的增殖分化方面起積極的作用，并且其能明顯抑制細(xì)胞凋亡速度。在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的研究中同樣發(fā)現(xiàn)這個(gè)機(jī)制的存在[6]。

絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中表面同樣存在STOX1，它可以激活α-T-連環(huán)蛋白的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而破壞絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力[7]。人們認(rèn)識(shí)到當(dāng)細(xì)胞有絲分裂的啟動(dòng)子細(xì)胞周期蛋白B1與STOX1結(jié)合識(shí)別后，可明顯正反饋激發(fā)增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的過(guò)表達(dá)，從而加速細(xì)胞分裂速度，誘發(fā)細(xì)胞增殖分化[8]。目前人們?cè)贑D47對(duì)STOX1干預(yù)及二者與絨毛發(fā)育的相關(guān)性認(rèn)識(shí)上尚不明確。

在本項(xiàng)研究中，筆者以孕早期正常染色體的絨毛作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)絨毛細(xì)胞凋亡率隨著孕周增加相應(yīng)降低。在CD47轉(zhuǎn)染的絨毛細(xì)胞中其凋亡率明顯更低。說(shuō)明絨毛細(xì)胞隨著孕周增加其穩(wěn)定性增加。在抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖上CD47起著積極作用，能顯著加固絨毛的穩(wěn)定性。

滋養(yǎng)細(xì)胞的順利形成到胎盤(pán)良好發(fā)育對(duì)妊娠成功至關(guān)重要，有研究發(fā)現(xiàn)STOX1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)絨毛和胎盤(pán)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程起著積極參與作用[9-11]。本次研究發(fā)現(xiàn)在隨著孕周增加絨毛中STOX1 mRNA表達(dá)也有相應(yīng)增高趨勢(shì)。CD47干預(yù)后的絨毛細(xì)胞中STOX1 mRNA表達(dá)相對(duì)未干預(yù)各對(duì)應(yīng)組明顯升高。提示STOX1的表達(dá)受CD47因子正反饋影響，并對(duì)絨毛細(xì)胞的增殖、侵襲及抗凋亡起積極作用。從二者的相關(guān)性筆者推斷STOX1 是CD47下游調(diào)節(jié)因子，CD47通過(guò)正向干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞上STOX1的表達(dá)，能有效地抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，絨毛組織中CD47高表達(dá)可正反饋上調(diào)STOX1的表達(dá)，并隨著孕周進(jìn)展干預(yù)效果也越明顯。CD47及STOX1可能通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡參與絨毛的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，對(duì)妊娠的成功維持起著重要的作用。本次研究對(duì)流產(chǎn)靶向免疫治療做了初步探索，關(guān)于它們?nèi)绾螀⑴c流產(chǎn)的具體分子通路及調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步研究闡明。