馬學(xué)平，高建煒，韓 坤，楊 聰，海 娥，樸東日，姜 海，崔步云，趙建華

布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌是引起布魯氏菌病(Brucellosis)的病原體[1]，目前分為6個(gè)種19個(gè)生物型[2]，羊種、豬種和牛種是感染人體的主要種型[3]，羊種是我國(guó)主要的感染人體種型[4]。布魯氏菌由于具有廣泛的宿主和遺傳多樣性，其種間核苷酸序列一致性在99%以上[5]，傳統(tǒng)方法分型煩瑣，具有生物安全風(fēng)險(xiǎn)。多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、分辨率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于布魯氏菌分型中[6-9]，是流行病學(xué)調(diào)查溯源的補(bǔ)充方法。本研究采用多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析方法對(duì)寧夏68株布魯氏菌進(jìn)行分型研究，闡述其分子特征，為布魯氏菌病疫情暴發(fā)溯源提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 一般材料：44株臨床分離菌株于2009-2013年從寧夏地區(qū)感染布魯氏菌現(xiàn)癥病人血液樣本中分離獲得，歷史保藏的24株菌株和16M、544A、1330S參考菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所布病研究室提供，菌株鑒定與MLVA分型實(shí)驗(yàn)在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所完成。

1.2 試劑與儀器：法國(guó)BioMerieux,SA公司生產(chǎn)的雙相血培養(yǎng)瓶；上海生工生物工程股份有限公司合成的AMOS-PCR引物、MLVA-16引物，北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成測(cè)序；DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。儀器設(shè)備S1000TM型基因擴(kuò)增儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像儀由BIO-RAD 公司生產(chǎn)；DDY-6C 型電泳儀由北京六一廠生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 布魯氏菌培養(yǎng)分離：負(fù)壓雙相血培養(yǎng)瓶采集具有牛羊等動(dòng)物接觸史、臨床癥狀和經(jīng)血清學(xué)確診為感染布魯氏菌急性發(fā)作期病人血液3～5 mL，輕輕振蕩血培養(yǎng)瓶使液相培養(yǎng)基與血液充分混勻置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d觀察1次血培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)情況，并傾斜培養(yǎng)瓶使液相培養(yǎng)物浸沒固相培養(yǎng)基表面。如果固相培養(yǎng)基表面觀察到菌落生長(zhǎng)時(shí)，挑取可疑菌落接種于布氏瓊脂平板傳代培養(yǎng)，如果液體渾濁挑取1環(huán)培養(yǎng)液接種于布氏瓊脂平板傳代培養(yǎng)觀察；如果無(wú)菌生長(zhǎng)則繼續(xù)培養(yǎng)至30 d 左右，仍無(wú)菌生長(zhǎng)，則高壓滅菌后按醫(yī)療廢棄物處置。

1.3.2 布魯氏菌鑒定

1.3.2.1 傳統(tǒng)生物學(xué)特性鑒定:根據(jù)培養(yǎng)特性、二氧化碳需求、菌落生長(zhǎng)時(shí)間和形態(tài)觀察，革蘭氏染色和柯氏染色初步判定布魯氏菌。接種觀察硫堇、堿性復(fù)紅染料抑菌試驗(yàn)，A、M(血清)單相特異性凝集和粗糙型R(血清)凝集試驗(yàn)，Tb、BK2、Wb(噬菌體)裂解試驗(yàn)。

1.3.2.2 AMOS-PCR方法鑒定: AMOS-PCR(AMOS是牛、羊、綿羊附睪和豬種布魯氏菌的英文名稱的第一個(gè)字母)引物按參考文獻(xiàn)的方法合成[10]。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl,引物各0.5 μl(10 μmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U),模板1 μl，去離子水14.5 μl。PCR反應(yīng)程序:93 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，60 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min,共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像分析儀拍照分析。

1.3.3 MLVA分型：分型引物及擴(kuò)增體系參考文獻(xiàn)[7]。MLVA反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U/μl)，引物各1 μl(10 pmol/μl)，DNA 模板1 μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)至25 μl。擴(kuò)增參數(shù):95 ℃ 預(yù)變性5 min，然后以 95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳得到產(chǎn)物片段的大小，送基因公司進(jìn)行毛細(xì)血管電泳測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：根據(jù) PCR 產(chǎn)物大小換算為重復(fù)單位數(shù)，采用 Bio Numerics 5.0軟件，利用非加權(quán)配伍組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)生物學(xué)特性鑒定結(jié)果：利用雙相血培養(yǎng)瓶分離到可疑布魯氏菌后經(jīng)單項(xiàng)特異性血清A、M和R凝集，染料抑菌，噬菌體裂解，CO2需求，H2S等試驗(yàn)鑒定，近期臨床分離44株菌均為羊種生物3型布魯氏菌。歷史保藏菌株鑒定結(jié)果為：12株羊種布魯氏菌、3株牛種布魯氏菌和9株豬種布魯氏菌，見表1。

表1 寧夏布魯氏菌分離株生物學(xué)特性鑒定結(jié)果

菌株編號(hào)陽(yáng)性血清特異性凝集血清RAM噬菌體裂解TbWbBK2菌株種/型分離地點(diǎn)宿主NX201209+-++--+羊3吳忠市病人NX201210+-++--+羊3吳忠市病人NX201301+-++--+羊3吳忠市病人NX201302+-++--+羊3銀川市病人NX201303+-++--+羊3吳忠市病人NX201304+-++--+羊3吳忠市病人NX201305+-++--+羊3吳忠市病人NX201306+-++--+羊3吳忠市病人NX201307+-++--+羊3鹽池縣病人NX201308+-++--+羊3吳忠市病人NX201309+-++--+羊3吳忠市病人NX201310+-++--+羊3鹽池縣病人NX201311+-++--+羊3鹽池縣病人NX201312+-++--+羊3鹽池縣病人NX201313+-++--+羊3鹽池縣病人NX201314+-++--+羊3鹽池縣病人NX201315+-++--+羊3鹽池縣病人NX201316+-++--+羊3鹽池縣病人NX201317+-++--+羊3平羅縣病人NX201318+-++--+羊3平羅縣病人NX201319+-++--+羊3鹽池縣病人NX201320+-++--+羊3吳忠市病人NX201321+-++--+羊3鹽池縣病人

2.2 AMOS-PCR鑒定結(jié)果：采用AMOS-PCR鑒定布魯氏菌，結(jié)果顯示羊種布魯氏菌均擴(kuò)增出2條特異性片段，大小為731 bp和178 bp，牛種布魯氏菌擴(kuò)增出2條特異性片段，大小為498 bp和178 bp，豬種布魯氏菌擴(kuò)增出2條特異性條帶，大小為285 bp和178 bp。

2.3 MLVA分型結(jié)果：采用 MLVA-16 分型方法對(duì)68株布魯氏菌進(jìn)行分析，經(jīng)擴(kuò)增電泳檢測(cè)合格后，PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序，用Bio Numerics 4.0軟件聚類分析后，按照相似度80%劃分，68株菌可被分為8大基因群、39個(gè)基因型。從種群分布看，68株菌按種分為3大群，56株羊種布魯氏菌共分為33個(gè)基因型，最多的在同一基因型中有7株布魯氏菌。9株豬種布魯氏菌分為3個(gè)基因型，3株牛種布魯氏菌分為3個(gè)基因型。在地區(qū)分布上具有明顯的地域性，近期分離羊種布魯氏菌各市、縣大部分均能處在同一基因型，尤其是吳忠市和鹽池縣分離的菌株均能聚在一起，平羅縣和紅寺堡各分離2株菌均處在同一基因型。

結(jié)合流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)吳忠市分離的菌株NX201201和NX201206，NX201303和NX201305同為一家人，具有同樣的接觸史、發(fā)病時(shí)間，且分離菌株時(shí)間相同，與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果吻合。從時(shí)間分布看，近期分離的菌株大部分聚在一起，歷史菌株中發(fā)現(xiàn)NX79033、NX79085與近期紅寺堡分離菌株NX200905、NX201001處在同一基因型，提示具有本土傳染源引起感染存在的可能性。

3 討論

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，布病疫情有回升的勢(shì)頭，全國(guó)各地布病檢測(cè)陽(yáng)性率和患病率逐年上升[11]。寧夏布病疫情與全國(guó)一致，也保持著上升的勢(shì)頭，2004-2010年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，報(bào)告發(fā)病率從0.017/10萬(wàn)上升到3.141/10萬(wàn)，職業(yè)以農(nóng)民居多，占69.94%，疫區(qū)范圍不斷擴(kuò)大，地區(qū)分布不均衡，患者以男性青壯年為主[12]。2018年布病發(fā)病率達(dá)24/10萬(wàn)以上，說(shuō)明寧夏的布病疫情一直處于高發(fā)攀升水平。寧夏20世紀(jì)就開展了病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作，自1958年寧夏首次在軍馬場(chǎng)確診病人體內(nèi)分離到羊種布魯氏菌后，至1989年該區(qū)共分離到布魯氏菌138株，包括4個(gè)種12個(gè)生物型，其中引起人體感染的主要種型為羊種布魯氏菌[13]。2009年寧夏開展布病病原學(xué)監(jiān)測(cè)以來(lái)，主要菌型為羊種3型布魯氏菌，說(shuō)明近期分離布魯氏菌種型與以往感染人體主要菌型一致。

近年來(lái)，不同的分子分型方法用于布魯氏菌分型，常用的有聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RELP)[14]、AMOS-PCR[15]、單核苷酸多態(tài)性研究(SNP)[16]、多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)等[17]。MLVA技術(shù)用于布魯氏菌基因分型操作簡(jiǎn)單，分辨力高和可重復(fù)性較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于分析，可以追溯傳染源，確定流行趨勢(shì)。目前該方法已廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌[18]、炭疽芽孢桿菌[19]、大腸埃希菌O157:H7[20]以及腸炎沙門菌[21]等一些細(xì)菌的分型分析。本研究采用Le Fleche P建立的布魯氏菌MLVA-16分型引物，對(duì)寧夏近期分離布魯氏菌和歷史菌株共68株進(jìn)行分析，結(jié)果表明，按相似度80%劃分，68株菌可被分為8大基因群、39個(gè)基因型，表明寧夏目前流行的布魯氏菌存在豐富的基因多態(tài)性。從地理位置分析，寧夏與內(nèi)蒙古、甘肅、陜西等省區(qū)接壤，周邊省區(qū)畜牧業(yè)發(fā)達(dá)，是寧夏的畜牧流動(dòng)集散地，同時(shí)由于畜牧業(yè)的發(fā)展引進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物，加之本土布魯氏菌病的流行，當(dāng)?shù)胤蛛x到的菌株顯示出豐富的基因多態(tài)性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合病人發(fā)病時(shí)間、菌株分離時(shí)間、分離地區(qū)等流行病調(diào)查資料推斷，極有可能是同一傳染源造成不同接觸者的感染發(fā)病，具體到同一個(gè)基因型的其他菌株，還需要開展流行病學(xué)調(diào)查來(lái)更進(jìn)一步做系統(tǒng)分析。

根據(jù)以上研究結(jié)果，通過(guò) MLVA 分析可以及時(shí)掌握傳染源的流動(dòng)，盡早控制、撲滅傳染源，為布病的防制提供有力的分子生物學(xué)依據(jù)，對(duì)布病傳染源追蹤、暴發(fā)流行調(diào)查等具有非常重要的意義。