羅凌云 廖偉鋒

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院粵東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東梅州 514700

卒中俗稱腦中風(fēng)，是危害人類最為嚴(yán)重的腦血管病之一，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點，已成為我國居民死亡原因之首[1]。靶向移植間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）為腦梗死的干細(xì)胞移植開拓新的領(lǐng)域，具有易于采集、免疫原性低、擴(kuò)增能力強(qiáng)、成瘤性低等優(yōu)點。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）已有一些小規(guī)模臨床試驗證明MSCs對腦梗死患者是安全和有效的，且采集方便擴(kuò)增能力強(qiáng)。由于血腦屏障的存在，外周靜脈注射的MSCs向病變腦組織靶向歸巢少，會影響治療效果，而頸動脈注射和立體定向注射MSCs可使更多MSCs遷移至病變腦組織，但存在風(fēng)險，不利于反復(fù)進(jìn)行[2]。低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡開放血腦屏障是一個血管細(xì)胞系統(tǒng)，它可以防止毒性的物質(zhì)傷害腦組織。微泡的研究及應(yīng)用拓展和深化了超聲的應(yīng)用范圍，能顯著降低超聲波產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的能量閾值，減輕組織損傷，增強(qiáng)空化效應(yīng)，磁共振成像（MRI）增強(qiáng)掃描是迄今最迅速便捷的監(jiān)測BBB開放的手段[3-4]。我們將探討MRI引導(dǎo)下用低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡輻照靶向性開放梗死區(qū)的血腦屏障，促進(jìn)靜脈注射的臍帶來源的MSCs進(jìn)入梗死區(qū)域，從而增加神經(jīng)修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 研究方案

1.1.1 MCAO大鼠模型的建立 清潔級SD大鼠80只，重量260～300g，雌雄各半（北京HFK生物技術(shù)有限公司）。用2%戊巴比妥鈉麻醉（40mg/kg） （山東新華制藥股份有限公司，H37020271），背位固定于大鼠手術(shù)臺，頸部正中切口2～2.5cm，分離雙側(cè)甲狀腺，鈍性分離肌群后暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。結(jié)扎頸外動脈、頸總動脈，在頸外動脈距頸總動脈分叉部約1～2mm處剪一小口，經(jīng)該切口將特制栓線插入頸內(nèi)動脈，阻塞大腦中動脈起始部。60min后拔出線栓，恢復(fù)腦血流灌注。大腦中動脈閉塞和再灌注均通過TCD檢查證實。

1.1.2 制備納米微泡 制備帶正電荷的納米微泡，即稱取一定量的HEPC、DSPE-PEG2000、DOTMA（正電荷脂質(zhì)）完全溶解于氯仿并置于培養(yǎng)皿中，在通風(fēng)櫥內(nèi)待氯仿自然揮發(fā)形成磷脂薄膜，加入水化液，37℃下?lián)u床上水化60min后移至50mL離心管內(nèi)，全氟丙烷氣體置換離心管上方空氣后再用超聲破碎儀進(jìn)行聲振，聲振儀探頭置于氣液交界處。所得液體通過低速、高速離心獲得納米2級脂質(zhì)微泡造影劑，在注射前新鮮配置。

1.1.3 MSCs的超順磁氧化鐵（SPIO）標(biāo)記 轉(zhuǎn)染了EGFP質(zhì)粒的臍帶來源的MSCs由申報單位的生物治療中心提供。向第4代MSCs培養(yǎng)基內(nèi)加入SPIO，使鐵的終濃度為 50μg/mL，在 37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。通過普魯士藍(lán)染色判斷SPIO標(biāo)記是否成功，并用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。

1.1.4 低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡注射和MSCs注射 實驗動物隨機(jī)分為四組：對照組（MCAO組）；超聲微泡組；MSCs組；超聲微泡+MSCs組。每組20只，雌雄各半。各組均在MCAO模型建立后的12h進(jìn)行處理。進(jìn)行超聲微泡輻照時使用3.0T MR定位，用3%戊巴比妥鈉肌注麻醉動物，仰臥固定于MRI立體定向治療系統(tǒng)中，MRI掃描器采用臨床標(biāo)準(zhǔn)3.0T信號系統(tǒng)。每次照射前校正系統(tǒng)焦點坐標(biāo)，根據(jù)MRI T2信息調(diào)系統(tǒng)焦點至目標(biāo)區(qū)域—右側(cè)內(nèi)囊后肢、右側(cè)中央前回。實驗采用三種MRI掃描序列分別為：照射前T2相掃描（TR：2000msec，TE：75msec，2次采集）獲取骨窗信息；實驗中T1相掃描（TR：500msec，TE：15msec，2次采集）實時監(jiān)測腦組織。并行MRA和動脈自旋標(biāo)記（ASL）成像。注射MSCs時由尾靜脈推注納米微泡1mL和MSCs懸液（細(xì)胞總數(shù)分別為1×105個），同時用小動物超聲探頭行超聲照射，照射頻率分別為0.2、0.5和0.8MHz，照射時間分別為 10、30和 60s。非 MSCs治療組則注入生理鹽水1mL。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 治療前后大鼠的神經(jīng)功能評分 各組治療前及處理后2周和4周再次進(jìn)行神經(jīng)功能評估。0分，無能缺損癥狀；1分，不能完全伸展左側(cè)前爪；2分，完全不能完全伸展左側(cè)前爪；3分，輕度向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重地向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分，向左側(cè)傾倒。評分為1～4分者視為造模成功。

1.2.2 組織學(xué)檢測 各組在MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療減少腦梗死病大鼠黑質(zhì)TH陽性和DAT陽性神經(jīng)元的凋亡情況；提取總蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測營養(yǎng)因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本間采用方差分析，計數(shù)資料用構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后大鼠的神經(jīng)功能評分比較

四組大鼠治療后的神經(jīng)功能評分均有所下降，且超聲微泡組、MSCs組、超聲微泡+MSCs組治療2周和4周評分均較對照組更低，超聲微泡+MSCs組治療后神經(jīng)功能評分最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），見表 1。

圖1 MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療減少腦梗死病大鼠黑質(zhì)TH陽性和DAT陽性神經(jīng)元的凋亡情況

表2 治療后大鼠營養(yǎng)因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量比較（x ± s，Pg/mL）

2.2 MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療減少腦梗死病大鼠黑質(zhì)TH陽性和DAT陽性神經(jīng)元的凋亡情況

MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療減少腦梗死病大鼠黑質(zhì)TH陽性和DAT陽性神經(jīng)元的凋亡，減少了氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷，見圖1（A為TH，B為DAT）。

2.3 治療后大鼠營養(yǎng)因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量比較

四組大鼠治療后大鼠營養(yǎng)因子與對照組比較，顯著升高，超聲微泡+MSCs組升高最高，療效最好，見表2。

3 討論

腦中風(fēng)是危害最為嚴(yán)重的腦血管病之一，據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)存腦卒中患者750萬，每年新增卒中患者約250萬，約3/4不同程度地喪失了勞動力。目前我們采用靜脈溶栓、血管介入治療等積極措施，并使用抗血小板、調(diào)脂藥、清除自由基、促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)、康復(fù)等綜合治療[5-7]。盡管如此，仍有許多腦梗死患者遺留殘疾。因此腦梗死患者的神經(jīng)修復(fù)是目前迫切需要攻克的難題[8-10]。已有較多體外實驗和動物實驗的文獻(xiàn)支持MSCs通過神經(jīng)再生、促進(jìn)血管再生、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)自噬和促進(jìn)突觸形成等機(jī)制產(chǎn)生保護(hù)梗死組織[11-13]。低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡開放血腦屏障（BBB），阻止了所有大分子物質(zhì)和多于98%的小分子物質(zhì)進(jìn)入腦，因此BBB在維護(hù)腦穩(wěn)態(tài)的同時也成為治療中難以逾越的屏障[13-15]。微泡能顯著降低超聲波產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的能量閾值，減輕組織損傷，增強(qiáng)空化效應(yīng)，它在超聲介導(dǎo)下可引起空化作用，在這一過程中產(chǎn)生的能量可引起聲孔效應(yīng)[13-14，16-17]。為確保聚焦超聲體外無創(chuàng)治療的安全性和有效性，影像學(xué)的實時監(jiān)控和療效評價至關(guān)重要。磁共振成像可以增強(qiáng)掃描法檢測BBB可逆性開放的準(zhǔn)確性和可靠性較高。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)可表現(xiàn)出神經(jīng)元的形態(tài)，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物如TU-20、Trk A等，同時可分泌粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等因子。MSCs促進(jìn)梗死組織恢復(fù)的機(jī)制推測與神經(jīng)再生、血管形成、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)自噬、促進(jìn)突觸形成和維持代謝平衡等有關(guān)，研究者通過頸內(nèi)動脈注射自體BMSCs的方法使腦梗死患者的臨床評分（NIHSS、mRS）較對照組改善顯著[5，18-19]。

研究發(fā)現(xiàn)，MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療腦梗死大鼠可以顯著提高大鼠的神經(jīng)功能，MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療減少腦梗死病大鼠黑質(zhì)TH陽性和DAT陽性神經(jīng)元的凋亡，減少了氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷，營養(yǎng)因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量也顯著增高。

MRI介導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合納米微泡對提高M(jìn)SCs治療腦梗死大鼠可以促進(jìn)腦梗死的神經(jīng)修復(fù)以改善預(yù)后，減輕社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的臨床價值和社會意義。