張 麗，李曉嵐

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一種可累及多種器官組織并以淋巴細胞異常活化、大量自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物形成為特征的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機制尚未闡明，微生物如細菌或病毒感染可通過模擬自身抗原機制誘發(fā)本病或致病情復(fù)燃。隨著SLE治療水平的不斷提高，患者因SLE疾病本身所致的死亡降低，而因治療藥物所導(dǎo)致的并發(fā)癥如感染等卻導(dǎo)致死亡增加。Toll樣 受 體2（Toll like receptor 2,TLR2） 和Toll樣受體 4（Toll like receptor 4,TLR4）是先天固有免疫的重要因子，在抗菌抗感染免疫中起著主要作用，可激活下游信號分子絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-actived protein kinase p38,p38MAPK）和核因子κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）,從而誘導(dǎo)大量細胞因子及炎癥因子產(chǎn)生，加重SLE的炎癥反 應(yīng)[1、2]。A20（Tumor necrosis factor α-l induced protein 3,TNFAIP3）基因作為SLE的易感基因，其異常表達與SLE的發(fā)病密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)A20基因缺陷的小鼠對LPS及TNF的敏感性異常增強，此外還發(fā)現(xiàn)SLE患者異常低表達A20蛋白可致p38MAPK及NF-κB持續(xù)過度活化[3-5]。本研究利用瑞香素（Daphnetin）可刺激提高A20蛋白水平而發(fā)揮其抗炎作用的特性[5]，通過注射瑞香素提高SLE模型小鼠PBMC中A20蛋白的水平，觀察能否抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號通路以緩解SLE小鼠的炎癥反應(yīng)，為臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 （4～5）周齡MRL/lpr和BALB/c雌性小鼠，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.1.2 實驗藥品與主要試劑 瑞香素，小鼠外周血單個核細胞分離液，BCA蛋白定量試劑盒，考馬斯亮藍G-250（大連美侖生物公司）；小鼠尿素氮試劑盒（Solarbio公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體，兔抗小鼠β-actin多克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，小鼠IL-6 ELISA 試劑盒，小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（Proteintech公司）；小鼠anti-dsDNA IgG ELISA試劑盒（Alpha Diagnostic公司）；兔抗小鼠NFκB-p65多克隆抗體，兔抗小鼠pNFκB-p65多克隆抗體，兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體，兔抗小鼠pp38MAPK多克隆抗體（CST公司）；兔抗小鼠A20多克隆抗體，兔抗小鼠TLR4多克隆抗體，兔抗小鼠TLR2多克隆抗體（萬類生物公司）。

1.1.3 主要設(shè)備 分光光度計，酶標(biāo)儀（Thermo公司）；Western blot電泳儀（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 36只MRL/lpr和18只BALB/c雌性小鼠均由中國科學(xué)院昆明動物研究所統(tǒng)一飼養(yǎng)（清潔級）。隨機將兩類小鼠分為BALB/c小鼠陰性對照組（Sham，n=18）、MRL/lpr小鼠未處理組（SLE，n=18）、MRL/lpr小鼠瑞香素處理組（Daphnetin，n=18）。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，治療組小鼠1次/d經(jīng)腹腔注射100μl瑞香素溶液（瑞香素，4mg/kg），連續(xù)6周；同時未治療組及陰性對照組1次/d經(jīng)腹腔注射100μl生理鹽水，連續(xù)6周。在此期間注重觀察各組小鼠毛發(fā)及體重的變化以及生存率。給藥結(jié)束后，取各組小鼠24h尿液并用分別盛有分離膠、促凝劑及肝素鈉的離心管經(jīng)內(nèi)眥靜脈收集全血，隨后將含有促凝劑的全血經(jīng)3 000 r·min-1離心10min，分離得到血清；向含有肝素鈉的全血中加入等體積的PBS進行稀釋，并用小鼠外周血單個核細胞分離液分離出外周血單個核細胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解后離心取上清為蛋白樣品，再用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。隨即將處理得到的樣本-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 指標(biāo)檢測 ① 小鼠毛發(fā)及體重的變化和生存率：直至給藥結(jié)束期間，每周測量各組小鼠平均體重以及記錄各組小鼠死亡情況，并在此期間觀察各組小鼠毛發(fā)的變化，拍照記錄。② 腎臟功能評估：利用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白以及用小鼠血尿素氮檢測試劑盒檢測血尿素氮，按試劑說明書操作。 ③ ELISA法 檢 測anti-dsDNA IgG、TNF-α及IL-6：取保存?zhèn)溆玫难?，步驟按試劑盒說明書操作。④ Western Blot法檢測A20、NFκB-p65、pNFκB-p65、p38MAPK、pp38MAPK以及TLR2、TLR4蛋白表達情況：將待測蛋白進行等量蛋白上樣，Marker上樣5μl，進行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)條件以100mA/200V/90min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3h后一抗封閉過夜，二抗孵育2h后洗膜滴顯影劑采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準差（±s），采用單因素方差分析（One-way ANOVA）統(tǒng)計組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 小鼠一般情況 實驗開始前，各組小鼠毛發(fā)順滑有光澤，進食正常，狀態(tài)良好。實驗結(jié)束后，SLE組小鼠消瘦，毛發(fā)凌亂、脫落、干枯無光澤；Daphnetin組狀態(tài)較好，同Sham組小鼠毛發(fā)依然順滑、有光澤。SLE組小鼠6只死亡，Daphnetin組小鼠2只死亡，Sham組小鼠無一死亡（圖1）。

2.2 小鼠體質(zhì)量變化情況 在取樣前，SLE組小鼠第8周齡時平均體質(zhì)量增加幅度較Daphnetin組變緩，第9周齡時SLE組小鼠平均體質(zhì)量開始持續(xù)下降，變得消瘦；相反，Daphnetin組小鼠平均體質(zhì)量持續(xù)增加，直至取樣；Sham組小鼠平均體質(zhì)量增至7周齡時不再變化（圖2）。

圖1 小鼠一般狀態(tài)

圖2 三組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.3 小鼠生存率分析 三組小鼠的存活率分別為Sham組：100%；SLE組：66.7%；Daphnetin組：88.9%。Daphnetin組和Sham組小鼠存活率都高于SLE 組（圖 3）。

圖3 三組小鼠生存率示意圖

2.4 小鼠A20蛋白的表達 Daphnetin組小鼠PBMC中A20蛋白表達顯著高于SLE組小鼠；Sham組小鼠和SLE組小鼠PBMC中A20蛋白表達沒有顯著差別（圖4）。

圖4 A20蛋白在小鼠中的高表達

圖5 A20高表達降低了小鼠尿蛋白和血尿素氮水平

2.5 小鼠尿蛋白和血尿素氮水平 SLE組小鼠尿蛋白及血尿素氮水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠尿蛋白及血尿素氮水平低于SLE組小鼠（圖5）。2.6 小鼠血清anti-dsDNA IgG水平 SLE組小鼠血清anti-dsDNA IgG水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠血清anti-dsDNA IgG水平低于SLE組小鼠（圖6）。

圖6 A20高表達降低了小鼠血清anti-dsDNA IgG水平

2.7 小鼠血清IL-6、TNF-α水平 SLE組小鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠血清IL-6、TNF-α水平低于SLE組小鼠（圖7）。

圖7 A20高表達降低了小鼠血清IL-6、TNF-α水平

2.8 小鼠TLR2、TLR4蛋白的表達及pNFκB-p65、pp38MAPK活性 SLE組小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表達顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表達低于SLE組小鼠（圖 8）。

3 討論

圖8 A20抑制了小鼠TLR2、TLR4、pNFκB-p65和pp38MAPK蛋白的表達

近年來，通過研究抑制信號傳導(dǎo)通路減少細胞炎癥因子的釋放，從而控制 SLE的進展，已經(jīng)成為治療SLE的新思路。多項研究表明，SLE患者出現(xiàn) p38MAPK 及 NF-κB 過度活化的現(xiàn)象[6、7]，而這兩條信號通路受多分子調(diào)控，其中就包括Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）。作為天然免疫與獲得性免疫的橋梁，有研究報道SLE患者體內(nèi)存在TLRs表達水平的異常，不同的TLRs發(fā)揮著協(xié)同或不同的作用，TLR2和TLR4作為細菌感染的主要受體，可通過識別病原體病原相關(guān)分子模式與相應(yīng)配體結(jié)合而啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，通過激活p38MAPK及NF-κB最終引起大量促炎因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的分泌，導(dǎo)致SLE患者腎臟、肝臟等多臟器的損傷[8]。有報道稱SLE患者穩(wěn)定組、活動組和合并感染組外周血PBMC中TLR2和TLR4表達明顯高于正常對照組，說明TLR2和TLR4在SLE的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。本研究通過MRL/lpr狼瘡小鼠模型，將MRL/lpr未治療組與陰性對照組比較，其結(jié)果表明，MRL/lpr未處理組小鼠較陰性對照組小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮明顯增多，血清anti-dsDNA IgG產(chǎn)生增加和血清IL-6、TNF-α 分 泌 增 多 以 及PBMC中TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK表達水平增加，提示TLR2、4-p38MAPK/NF-κB該信號通路積極參與了MRL/lpr狼瘡小鼠的發(fā)病機制。

A20作為一種具有強大抗炎功能的蛋白，利用自身N端的去泛素化功能和C端的泛素化活性，可以負調(diào)控作用于p38MAPK/NF-κB兩條信號通路上的多種信號分子，減少細胞炎癥因子的產(chǎn)生，這主要通過TNF途徑和TLR途徑來完成[9、10]。其中TLR主要由髓樣分化因子（MyD88）依賴及非依賴途徑激活，A20蛋白通過去除TRAF6泛素化從而抑制TLR途徑。有研究證實，當(dāng)IL-1β和LPS刺激后，可招募MyD88和TRAF6聚積至細胞內(nèi)的TLR/IL-1R區(qū)。A20通過去除TRAF6的K63多聚泛素鏈以及干擾TRAF6與Ubc13/H5的結(jié)合，使Ubc5和Ubc13被蛋白酶體降解來抑制TRAF6的泛素化作用和活化，進而抑制TAK1與下游信號分子的相互作用，從而達到抑制p38MAPK/NF-κB活化的目的[11]。在本研究中，與MRL/lpr未處理組小鼠比較，Daphnetin處理組小鼠PBMC中A20蛋白表達水平顯著提高。結(jié)果 顯示高表達的A20能改善狼瘡模型小鼠營養(yǎng)和生長狀況；高表達的A20能降低狼瘡模型小鼠促炎細胞因子IL-6、TNF-α和自身抗體anti-dsDNA IgG水平；高表達的A20能抑制TLR2、TLR4的表達及p38MAPK、NF-κB的活化；高表達的A20能減輕狼瘡相關(guān)的腎臟損傷使得小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮減少。因此，A20的高表達可抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號通路，從而明顯改善對MRL/lpr狼瘡模型小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，提高MRL/lpr狼瘡模型小鼠體內(nèi)的A20蛋白表達能顯著抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號通路，對MRL/lpr狼瘡模型小鼠的相關(guān)癥狀起著緩解和治療作用。由此可見，誘導(dǎo)提高抗炎分子A20的表達將有望成為治療SLE疾病的新策略。