楊梅，石兆勇,2,3*，盧世川，張夢歌，王旭剛，徐曉峰

1.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471000；2.洛陽市共生微生物與綠色發(fā)展重點實驗室，河南 洛陽 471000；3.中國科學院山地表生過程與生態(tài)調控重點實驗室，四川 成都 610041

土壤作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的碳庫，是大氣碳庫的3.3倍、生物碳庫的4.5倍，是全球碳循環(huán)的重要組成部分，是大氣CO2的源和匯（Lal，2004），土壤有機碳的貯量可達整個陸地生態(tài)系統(tǒng)的 2/3，在全球碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用（薛麗佳等，2011；Schlesinger，1990）。叢枝菌根（AM）真菌可以和絕大多數(shù)的微管植物根系形成互惠共生體（Chen et al.，2012；劉海躍等，2018），植物根系AM真菌侵染率則是通過侵染狀況反映植物與叢枝菌根真菌形成共生關系的重要標志，孢子密度則反映了叢枝菌根真菌的群落特征。而球囊霉素是由叢枝菌根真菌（AMF）分泌的一種含金屬離子的糖蛋白物質，按照提取的難易程度可將這種蛋白分為總提取球囊霉素（Total glomalin）和易提取球囊霉素（Easily extractable glomalin）（Wright et al.，1996；Wright et al.，1998），其在真菌孢子和菌絲衰亡降解后，釋放到土壤中（Comis，2002），成為土壤有機碳的重要組成和來源（郭亞楠等，2017）。球囊霉素是土壤穩(wěn)定有機碳庫的重要組成部分（Steinberg et al.，2003）。Wright et al.（1998）研究表明，球囊霉素含碳量可達土壤有機碳庫的30%—40%。Rillig et al.（2003）則認為球囊霉素是土壤碳庫的重要來源。Miller et al.（1995）研究表明，在熱帶沙漠土壤中，球囊霉素的含碳量占到土壤總碳的4%—5%，高于微生物生物量碳。謝靖等（2012）研究表明，在黃土高原，球囊霉素是土壤有機碳的重要來源。許偉等（2015）研究表明，在塞北荒漠草原，球囊霉素是土壤有機碳的重要組成和來源。郭亞楠等（2017）研究表明，在蒙古荒漠地區(qū)，球囊霉素是土壤有機碳的重要來源和組成成分?？梢?，在不同生態(tài)系統(tǒng)中，球囊霉素都作為土壤碳庫的重要組成部分。魯青原等（2016）就證實球囊霉素能促進土壤碳固定，其機制是通過固定土壤微粒，形成團聚體，從而保護了土壤有機質。田慧等（2009）進一步證實了球囊霉素不僅影響到土壤團聚體的結構和形成，且能增加土壤團聚體的穩(wěn)定性。

通常，氣溫增加能導致土壤有機碳的分解，因此，引起了廣泛關注。研究表明，溫度每升高1 ℃，全球土壤有機碳將分解 11—34 Gt，釋放出更多的CO2，從而又會加劇全球變暖（Rousk et al.，2015）。侯穎等（2008）研究也表明，全球氣候變暖能夠導致土壤微生物活動的增強，從而致使土壤有機質加速分解?？梢?，全球變暖后的溫度升高會使土壤有機碳加劇分解，導致其含量降低；而球囊霉素作為土壤碳庫的重要組成部分，其含量隨氣溫增加的變化，卻罕見報道。因此，本文選擇對氣候變化較為敏感的青藏高原地區(qū)，研究了模擬增溫對球囊霉素含量的影響。

青藏高原對全球氣候變化十分敏感（Shi et al.，2015）。這種獨特的地理環(huán)境為各種自然科學研究的開展提供了天然的“實驗室”（田玉強等，2009）。因此，本研究在此地展開，旨在探討土壤球囊霉素對全球增溫的響應及其貢獻，為叢枝菌根真菌生態(tài)功能的研究提供數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

研究地點在 29°20′—30°20′N 和 101°30′—102°15′E之間的青藏高原的東部，海拔高度為3000—4500 m。自然生態(tài)系統(tǒng)類型多樣，保存完好，受人類干擾程度低，有利于研究根際土壤和根系的采集。

1.2 試驗設計與樣品采集

在青藏高原3000、3500、3800、4170 m的4個海拔梯度上均設置了20 m×20 m的樣地，每個樣地分成25個4 m×4 m的樣方，然后隨機抽取10個不相鄰的樣方，在中心區(qū)域設置1 m×1 m的樣方，其中，5個作為對照，另5個進行OTC增溫處理。OTC增溫是最簡單和普遍使用的增溫方式，和其他增溫方式相比，可保證土壤基本不受到破壞和干擾，且操作簡單，成本低，易重復，十分適合野外觀測實驗的進行（張相鋒等，2018；Klein et al.，2004）。其頂部和底部均為六邊形，且均為開放式，側面為6塊梯形形狀的有機玻璃組成。增溫一年后發(fā)現(xiàn)，總體上溫度增加了1.4 ℃，在4個海拔梯度上的溫度動態(tài)變化范圍為0.6—2.4 ℃。采樣時在隨機抽取的 5個對照樣方中用打孔器采集直徑為 2 cm，深度為0—20 cm的土柱，將5個土柱混合作為一個樣品，重復5次。OTC增溫樣方取樣方法同上。然后，將土壤與根系分離開，并分別用自封袋進行封裝。整體上看，對照處理土壤含氮量為0.75%，增溫處理的土壤含氮量為0.53%。從不同海拔上看，對照處理的土壤含氮量在0.41%—1.48%之間，增溫后的土壤含氮量在0.44%—0.64%之間。

1.3 指標的測定

AM真菌侵染率按照Phillips et al.（1970）的方法進行測定，將采集的須根清洗干凈置于質量分數(shù)為10%的KOH溶液中，用90 ℃的水浴鍋水浴30 min，當根相對透明時，用自來水沖去堿液并置于體積分數(shù)為5%的醋酸溶液中浸泡5 min，然后放入體積分數(shù)為 5%的醋酸墨水溶液中經 90 ℃水浴加熱30 min進行染色，再用自來水洗凈并置于乳酸中，30 min后將根剪為1 cm長度制成玻片并在顯微鏡下進行觀察，最后計算侵染率的大小。

孢子密度按Gerdemann et al.（1963）的方法稱取 15 g的風干土采用濕篩傾析——蔗糖離心法篩取孢子然后在顯微鏡下進行觀察，并統(tǒng)計孢子數(shù)量。孢子密度采用每克風干土中的孢子數(shù)來表示。

球囊霉素按照Wright（1996）和David（2008）的方法分別測定了總提取球囊霉素和易提取球囊霉素。

總提取球囊霉素測定方法為取1 g風干土于試管中，加入8 mL檸檬酸鈉（50 mmol·L-1，pH=8.0）在 103 kPa、121 ℃下浸提 60 min，再重復提取 2次，然后在6000 r·min-1下離心15 min并收集其上清液。易提取球囊霉素測定方法與總提取球囊霉素提取方法相似，只是檸檬酸鈉濃度為20 mmol·L-1，pH=7.0，浸提時間為90 min，然后離心，收集其上清液。然后分別吸取0.5 mL上清液加入5 mL考馬斯亮藍G-250染色劑，用分光光度計在595 nm波長下比色。用牛血清蛋白作為標準液，考馬斯亮藍法顯色，繪制標準曲線，即可求出球囊霉素含量。

1.4 數(shù)據分析

本研究統(tǒng)計檢驗采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和 Spearman相關系數(shù)分析，進行不同海拔梯度下，OTC增溫和對照處理中侵染率、孢子密度、總提取球囊霉素、易提取球囊霉素、總提取球囊霉素和易提取球囊霉素的比值的差異性以及土壤球囊霉素與其影響因素之間的關系。

2 結果分析

2.1 增溫對球囊霉素的影響

圖1 增溫對TG的影響Fig.1 Effect of warming on TG

通過測定4個不同海拔高度增溫和對照的總提取球囊霉素（TG）和易提取球囊霉素（EEG）含量發(fā)現(xiàn)，不論是總提取球囊霉素還是易提取球囊霉素在增溫后都沒有發(fā)生明顯變化。在總提取球囊霉素中（圖1），4個不同海拔的對照和增溫的平均總提取球囊霉素的含量分別為 4.27 mg·g-1和 4.35 mg·g-1。在對照處理中，其總提取球囊霉素含量在3.96—4.59 mg·g-1范圍內，且最大值和最小值分別出現(xiàn)在海拔3500 m處和海拔4170 m處；而在增溫處理中，總提取球囊霉素含量在 4.25—4.43 mg·g-1范圍內，且最大值和最小值分別出現(xiàn)在海拔3800 m處和海拔4170 m處。可見，無論是在增溫還是對照處理中，總提取球囊霉素含量的最低值都出現(xiàn)在4170 m海拔處，且增溫處理的最低值比對照處理的最低值要略微高一些，但并不顯著。并且，通過比較每個海拔的增溫和對照處理發(fā)現(xiàn)，二者在每個海拔都差異不顯著。表明增溫并沒有降低總提取球囊霉素的含量，也就是說，增溫條件下，總提取球囊霉素的含量并未受到不利影響。

圖2 增溫對EEG的影響Fig.2 Effect of warming on EEG

在易提取球囊霉素的結果中發(fā)現(xiàn)（圖2），增溫后4個不同海拔的易提取球囊霉素的平均值有所下降，但并不顯著。4個海拔的對照和增溫的易提取球囊霉素的含量的平均值分別為1.62 mg·g-1和1.52 mg·g-1。綜合考慮4個不同的海拔梯度增溫和對照處理時，發(fā)現(xiàn)其易提取球囊霉素含量在對照處理中處于1.51—1.75 mg·g-1范圍內，其最大值和最小值分別出現(xiàn)在海拔4170 m處和海拔3800 m處；而在增溫處理中，易提取球囊霉素含量處于 1.35—1.71 mg·g-1范圍內，其最大值和最小值分別出現(xiàn)在海拔3000 m處和海拔3800 m處，增溫前后易提取球囊霉素的最小值均出現(xiàn)在3800 m處。但在增溫和對照處理中，易提取球囊霉素含量在4個海拔中都差異不顯著（圖2）。說明增溫并沒有降低易提取球囊霉素的含量，即增溫對易提取球囊霉素的含量并沒有產生不利影響。

我們還進一步比較了4個不同海拔高度增溫和對照的易提取球囊霉素與總提取球囊霉素含量的比值，結果表明（圖3），4個不同海拔的對照和增溫的平均比值分別為0.38和0.36。對于4個不同的海拔梯度而言，綜合考慮增溫和對照處理時，對照處理中，其比值最高為 0.46，出現(xiàn)在海拔 4170 m處，而最低為0.35，出現(xiàn)在海拔3800 m處；而在增溫處理中，其比值最高為0.40，出現(xiàn)在海拔3000 m處，最低為0.31，出現(xiàn)在海拔3800 m處。進一步比較每個海拔增溫和對照的差異狀況，發(fā)現(xiàn)二者在海拔4170 m處差異顯著，而在其他3個海拔都差異不顯著（圖3）。

圖3 增溫對EEG 和TG的比值的影響Fig.3 Effect of warming on the ratio of EEG and TG

2.2 增溫對AM真菌侵染的影響

圖4 增溫對叢枝菌根侵染率的影響Fig.4 Effect of warming on arbuscular mycorrhizal colonization

植物根系菌根侵染率是植物與叢枝菌根真菌形成共生關系的重要標志，因此測定了4個不同海拔高度增溫和對照的菌根侵染率（圖4）。結果表明，無論是增溫還是對照處理，其菌根侵染頻率都很高；4個不同海拔的對照和增溫的平均侵染率分別為85.28%和88.38%?？梢?，增溫并不會降低植物的菌根侵染率，也就是說，增溫條件下，植物菌根共生關系的形成并未受到不利影響。對于4個不同的海拔梯度而言，綜合考慮增溫和對照處理時，其侵染率最高為96.53%，出現(xiàn)在海拔3000 m的增溫處理；而最低也為79.04%，則出現(xiàn)在海拔4170 m的對照處理。進一步比較每個海拔增溫和對照的差異狀況，發(fā)現(xiàn)二者在每個海拔都差異不顯著（圖4）。

2.3 增溫對孢子密度的影響

孢子密度反映了叢枝菌根真菌的群落特征，因此，測定了4個不同海拔高度增溫和對照的孢子密度（圖5）。結果發(fā)現(xiàn)，4個不同海拔的對照和增溫的平均孢子密度相差并不明顯，分別為19 ind·g-1和20 ind·g-1?？梢姡鰷夭⒉粫档椭参锏逆咦用芏?，也就是說，增溫條件下，其繁殖能力并未受到不利影響。綜合考慮增溫和對照處理時，在對照處理中，其孢子密度最高為 27 ind·g-1，最低為 14 ind·g-1；而在增溫處理中，孢子密度最高為24 ind·g-1，最低為15 ind·g-1，發(fā)現(xiàn)增溫并沒有使孢子密度發(fā)生明顯變化。通過進一步比較每個海拔的增溫和對照的差異狀況，發(fā)現(xiàn)二者在每個海拔都差異不顯著（圖5）。

圖5 增溫對孢子密度的影響Fig.5 Effect of warming on spore density

2.4 增溫對土壤碳的影響

從總體上看，OTC增溫后，土壤碳有所降低，從對照的7.35%，在增溫后降低為6.96%。從4個海拔梯度上看，在對照中，土壤碳最高為4170 m海拔處的8.46%，最低為3000 m海拔處的5.36%；而在增溫后，土壤碳最高為3800 m海拔處的8.20%，最低為3000 m海拔處的5.80%。從4個海拔梯度的整體來看，在3000 m和3800 m海拔處，OTC增溫后，土壤碳有所增加，但并不顯著。在3500 m和4170 m海拔處，OTC增溫后，土壤碳呈現(xiàn)減少趨勢，但也不顯著（圖6）。

圖6 增溫對土壤碳的影響Fig.6 Effect of warming on C in soil

增溫后，總提取球囊霉素與土壤碳的比值在3000 m海拔和 4170 m海拔處有所增加，但不顯著，在3500 m海拔和3800 m海拔處卻有所下降，但也不顯著（圖7）。增溫后，土壤易提取球囊霉素與土壤碳的比值在4個海拔梯度中都有所減少，但都并不顯著（圖8）。說明球囊霉素對土壤碳庫有所貢獻，且總提取球囊霉素對土壤碳庫的貢獻略大于易提取球囊霉素。

圖7 增溫對TG和土壤碳的比值的影響Fig.7 Effect of warming on the ratio of TG and C in soil

圖8 增溫對EEG和土壤碳的比值的影響Fig.8 Effect of warming on the ratio of EEG and C in soil

2.5 土壤球囊霉素與其影響因素之間的關系

在對照處理中，土壤碳與總提取球囊霉素（TG）、易提取球囊霉素（EEG）呈負相關關系（表1），與叢枝菌根侵染率、孢子密度呈正相關關系；而在增溫處理中，土壤碳與總提取球囊霉素和叢枝菌根侵染率呈負相關關系，與易提取球囊霉素和孢子密度呈正相關關系。在對照處理中，總提取球囊霉素與易提取球囊霉素呈正相關關系，且具有顯著性（P=0.025），與孢子密度也呈正相關關系，但不顯著，與叢枝菌根侵染率呈負相關關系；而在增溫處理中，總提取球囊霉素與易提取球囊霉素和叢枝菌根侵染率呈正相關關系，與孢子密度呈負相關關系。在對照處理中，易提取球囊霉素與叢枝菌根侵染率和孢子密度都呈負相關關系；而在增溫處理中，易提取球囊霉素與叢枝菌根侵染率始終保持負相關關系，但和孢子密度呈正相關關系。在對照處理中，叢枝菌根侵染率與孢子密度呈正相關關系；而在增溫處理中，叢枝菌根侵染率與孢子密度呈負相關關系。

3 討論

全球氣候變暖，土壤碳庫分解速度加快，而球囊霉素又是土壤碳庫的一部分。綜合模擬增溫后總提取球囊霉素和易提取球囊霉素含量變化的研究結果發(fā)現(xiàn)，在模擬增溫條件下，青藏高原不同海拔的土壤球囊霉素含量沒有發(fā)生明顯變化，說明球囊霉素在全球變暖的條件下并沒有起到加速土壤碳分解的作用，而是對土壤碳庫起到了穩(wěn)定的作用。這與王建等（2016）的研究表明土壤球囊霉素可以促進土壤中碳存儲的結論相似等。和鐘思遠等（2018）研究的球囊霉素可促進土壤碳固持的結論相似。且Rillig et al.（2001）的研究也表明由AMF分泌的球囊霉素可以進行較慢的碳循環(huán)來抵消土壤碳中的快速循環(huán)。本研究還對易提取球囊霉素與總提取球囊霉素含量的比值進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，增溫導致易提取球囊霉素與總提取球囊霉素含量的比值在3800 m和4170 m海拔處呈現(xiàn)出略微降低的趨勢，在3000、3500 m海拔處呈現(xiàn)出略微升高的趨勢，但結果都不顯著，而在4170 m海拔處呈現(xiàn)出顯著降低，這說明在4170 m海拔處易提取球囊霉素的含量與總提取球囊霉素的含量相比較多，但只有在較高的4170 m海拔處顯著，其他3個海拔都沒有明顯影響，此數(shù)據不具有代表性，還需要進一步深入探討研究。

因為侵染率能反映出植物與AM真菌之間的共生關系，侵染率越高，說明植物與AM真菌之間的共生關系越密切；侵染率越低，說明植物與AM真菌的共生關系不夠密切。因此本研究對AM真菌的侵染率進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，增溫導致叢枝菌根對植物的侵染率在3500 m海拔處呈現(xiàn)出略微降低的趨勢，在3000、3800、4170 m海拔處呈現(xiàn)出略微升高的趨勢，且變化幅度為3.1%。這表明增溫后侵染率并沒有表現(xiàn)出明顯的變化，說明增溫并沒有影響到植物與AM真菌之間的共生關系。出現(xiàn)這種原因可能與Carvaiho et al.（2015）報道的相似，其研究表明溫度對侵染率的影響主要在于實驗時間的長短以及溫度的最低溫取值。而球囊霉素含量之所以沒有受到增溫的影響，可能是叢枝菌根真菌對增溫的不敏感所導致的。

本研究還測定了叢枝菌根根際土壤的孢子密度的大小，孢子是菌根真菌儲存營養(yǎng)的重要器官和繁殖體（杜善周等，2008）。而土壤有機碳又是影響孢子密度的主要因素（Liu et al.，2017）。通過本研究發(fā)現(xiàn)：增溫導致叢枝菌根根際土壤的孢子密度在3500 m和4170 m海拔處呈現(xiàn)出略微降低的趨勢，在3000 m和3800 m海拔處呈現(xiàn)出略微升高的趨勢，但結果都不顯著。這表明叢枝菌根根際土壤的孢子密度的大小在增溫后并沒有發(fā)生明顯的變化，說明增溫并沒有影響到其繁殖能力。

表1 土壤碳、叢枝菌根侵染率、孢子密度、總提取球囊霉素和易提取球囊霉素相關性系數(shù)Table 1 Correlation coefficients of C in soil, mycorrhizal colonization, spore density, TG and EEG

研究發(fā)現(xiàn)，在3000 m和3800 m海拔處增溫后土壤碳增加，但不顯著，而3500 m和4170 m海拔處土壤碳呈現(xiàn)出下降的趨勢，且也不顯著。說明增溫對土壤碳并沒有明顯的影響，且對土壤碳庫起穩(wěn)定作用的球囊霉素也沒有影響。這與Wang et al.（2014）所研究認為的增溫對土壤總碳、有機碳含量沒有顯著影響結論相似。增溫后，TG與土壤碳的比值有略微的升高或降低，但都不顯著；且增溫后，EEG與土壤碳的比值在 4個海拔梯度中都有所下降，但并沒有呈現(xiàn)出顯著性，說明增溫并沒有影響球囊霉素對土壤碳庫的貢獻，且總提取球囊霉素對土壤碳庫的貢獻略大于易提取球囊霉素。

土壤全碳、叢枝菌根侵染率、孢子密度、總提取球囊霉素和易提取球囊霉素之間的相關關系在增溫后都有略微的變化，但只有總提取球囊霉素和易提取球囊霉素之間呈現(xiàn)顯著性（P=0.025）。

4 結論

本研究通過在青藏高原草地生態(tài)系統(tǒng)模擬增溫發(fā)現(xiàn)，從 4個海拔上來說，增溫不但沒有降低球囊霉素的含量，反而在 3個海拔中球囊霉素的含量都有略微增加；而增溫后易提取球囊霉素與總提取球囊霉素的比值在低海拔處有略微增加，在高海拔處卻降低；且增溫沒有降低植物與叢枝菌根的共生關系以及孢子密度；不僅如此，在各個海拔處，增溫也都沒有降低總提取球囊霉素對土壤碳庫的貢獻。