程 曦,劉進峰,劉麗虹,高亞琪

(1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術重點實驗室,河北 石家莊 051530; 2.石家莊市農(nóng)業(yè)技術推廣中心,河北 石家莊 050000)

玉米漿(Corn steep liquer,CSL)是濕磨法制備玉米淀粉的副產(chǎn)物,為廉價的有機氮源[1]。其富含的氨基酸、多肽及其他營養(yǎng)元素,在細菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、有機酸和維生素中均有成熟的應用[2-5];在霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素時有所應用[6];在放線菌發(fā)酵中,徐瑤等[7]研究了用玉米漿和0.5%硫酸銨替代酵母粉對阿維菌素合成的影響。這些應用方面的差異除了菌種特性不同,玉米漿在加工、儲存和運輸過程中質(zhì)量波動也限制了其作為廉價有機氮源的推廣應用[8]。

阿維菌素(Avermectins,AVMs)是阿維鏈霉菌在含有碳源、氮源、無機鹽和微量元素的培養(yǎng)基中,通氣攪拌深層發(fā)酵而得的殺蟲殺螨劑。作為高效低毒的生物農(nóng)藥及醫(yī)藥中間體,正逐步取代其他農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)上的應用。阿維菌素發(fā)酵液中含有8種組分,B1組分,尤其是B1a組分殺蟲效果最好,是商品化阿維菌素的主要組分[9-10]。自問世以來,隨著菌種的改良、配方及控制工藝的優(yōu)化,生產(chǎn)水平大幅提高,特別是隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展應用,中國科學院微生物研究所獲得了與阿維菌素高產(chǎn)相關包括aveR在內(nèi)的12個靶基因,并運用高通量篩選技術篩選高產(chǎn)菌株A56,使阿維菌素B1a發(fā)酵效價達到6.382 g/L[11]。近年來,工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵效價基本維持在6.3～6.5 g/L,進入平臺期。為進一步降低生產(chǎn)成本,使用廉價的玉米漿部分替代黃豆餅粉,不但可以降低生產(chǎn)成本,還可以將玉米漿變廢為寶。玉米漿中的蛋白主要以小分子氨基酸的形式存在,可作為速效的有機氮源;而黃豆餅粉中的蛋白只有被細胞水解后才能發(fā)揮作用,水解過程比較緩慢,細胞對蛋白的利用速度也比較慢,可作為緩效氮源,兩者在功能上是有區(qū)別的;玉米漿和黃豆餅粉雖然都是氮源,但是均含有少量的糖類,部分替代后,還涉及碳、氮平衡問題。另外還應考慮玉米漿中可能存在的限制性物質(zhì)對菌體生長或者產(chǎn)物合成的影響,所有這些均應在配方的優(yōu)化設計中考慮?；谏鲜霰尘?筆者在搖瓶及100 L發(fā)酵罐上研究了玉米漿部分替代黃豆餅粉工藝,為工業(yè)化生產(chǎn)降低阿維菌素成本提供理論支持。

1 材料及方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

菌種來自于河北省阿維菌素生物技術重點實驗室AVS-78。

1.1.2 50 L種子罐,100 L發(fā)酵罐

鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術公司產(chǎn)品,配備有補料、DO和pH等自動控制系統(tǒng)和具有數(shù)據(jù)采集及分析功能的軟件系統(tǒng)。

1.1.3 儀 器

超凈工作臺(SW-CJ-2G)購于蘇州凈化設備有限公司,臥式恒溫搖床(TS-211B)購于無錫瑪瑞特科技有限公司,高效液相色譜儀(P-230)購于大連依利特分析儀器有限公司,電熱恒溫干燥箱(DHG-9023A)購于上海環(huán)竟試驗設備廠。

1.1.4 玉 米 漿

玉米漿是河北興柏生物科技有限公司產(chǎn)品,常規(guī)檢驗主要理化指標如下:

外觀呈棕黃色,黏稠狀,芳香氣味。

氮質(zhì)量濃度>40 g/L,還原糖質(zhì)量濃度>20 g/L,溶磷質(zhì)量分數(shù)<1%,pH為3.8～4.2。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 搖瓶種子培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為玉米淀粉25 g/L,黃豆餅粉8 g/L,花生餅粉10 g/L,酵母膏4 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈷10 mg/L。

培養(yǎng)條件:搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,溫度28～29 ℃,時間45～50 h。

1.2.2 50 L種子罐培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為淀粉20 g/L,黃豆餅粉5 g/L,酵母粉5 g/L,花生粉5 g/L,氯化鈷20 mg/L;消后體積為35 L。

培養(yǎng)條件:溫度28～29 ℃,流量25～30 L/min,培養(yǎng)時間40～50 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(搖瓶及100 L發(fā)酵罐)

質(zhì)量濃度分別為淀粉170 g/L,黃豆餅粉28 g/L,酵母粉10 g/L,輕質(zhì)碳酸鈣1.6 g/L,硫酸銨0.3 g/L;淀粉酶質(zhì)量分數(shù)0.025%。

搖瓶培養(yǎng)條件:溫度27～28 ℃,轉(zhuǎn)速220 r/min,接種量2～3 mL,時間14～15 d。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件:溫度27～28 ℃,流量40～50 L/min,接種量6～7 L,發(fā)酵周期340～350 h。

1.3 測定方法

1.3.1 生物質(zhì)量分數(shù)測定

發(fā)酵液加2～3滴有機硅消泡劑,攪拌消沫,準確稱取發(fā)酵液100 g,加熱至100 ℃,抽濾,適量水洗,105 ℃烘干2 h至恒重(W1)。生物質(zhì)量分數(shù)表達式為

生物質(zhì)量分數(shù)=(W1-W0)/100

其中W0為濾布質(zhì)量。

1.3.2 效價測定

準確稱取發(fā)酵液2 mL,置于50 mL容量瓶中,加適量甲醇,超聲浸提15 min,定容,過濾,進HPLC系統(tǒng),色譜柱C18,250 mm×4.6 mm,流動相V(CH3OH)∶V(H2O)=90∶10,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長246 nm,進樣量20 μL,記錄峰面積,與標準品峰面積比較測定發(fā)酵液效價(μg/mL),其表達式為

1.4 實驗方案

實驗以替代120 m3發(fā)酵罐黃豆餅粉用量的25%,且生物質(zhì)量分數(shù)不變?yōu)榛鶞首龇桨冈O計。首先,確定配方中應添加玉米漿的數(shù)量來彌補減少的黃豆餅粉,以確保生物質(zhì)量分數(shù)不變。對減少的黃豆餅粉,用玉米漿設計了5個替代質(zhì)量分數(shù)分別為25%,50%,75%,100%,125%,搖瓶發(fā)酵考察不同替代量對效價的影響。其次,考察玉米漿中限制性物質(zhì)特別是磷酸鹽對發(fā)酵效價的影響。由于玉米漿中磷的質(zhì)量分數(shù)高達1%,如果玉米漿替代量過大,過量的磷可能影響菌體生長或產(chǎn)物合成。在發(fā)酵配方中添加K2HPO4·3H2O,并設計質(zhì)量濃度30 mg/L和50 mg/L考察對發(fā)酵效價的影響。再次,采用L9(34)正交試驗確定最優(yōu)配方組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同替代質(zhì)量分數(shù)對發(fā)酵效價的影響

蛋白質(zhì)需要在特定酸堿度、溫度的條件下才能完全水解?？紤]現(xiàn)工藝狀態(tài)蛋白水解程度及玉米漿與黃豆餅粉含氮量的差別,設計了5個不同替代質(zhì)量分數(shù),即玉米漿分別按減少黃豆餅粉質(zhì)量分數(shù)的25%,50%,75%,100%,125%添加,并搖瓶發(fā)酵考察不同替代質(zhì)量分數(shù)對效價的影響。每個替代水平做3個發(fā)酵瓶,取平均值±標準差表示(x±s),結(jié)果見圖1。數(shù)據(jù)顯示:當替代質(zhì)量分數(shù)為50%時,發(fā)酵效價最高,而且隨著替代質(zhì)量分數(shù)的增加,效價逐漸降低,這是由于阿維鏈霉菌菌絲生長和產(chǎn)物合成非偶聯(lián)。配方中氮源質(zhì)量濃度過高,發(fā)酵液黏度大,影響發(fā)酵液內(nèi)部質(zhì)量和能量的傳遞,生長期延長,產(chǎn)素期縮短;氮源質(zhì)量濃度過低,產(chǎn)素期雖然長,但是菌體總量小,發(fā)酵效價也不高。

圖1 不同替代質(zhì)量分數(shù)對發(fā)酵效價的影響Fig.1 Effects of different substitutions on fermentation titer

2.2 溶磷質(zhì)量濃度對發(fā)酵效價的影響

無機鹽在培養(yǎng)基中作為微生物生長代謝所需的生理活性物質(zhì)的組成成分或調(diào)節(jié)劑,在高濃度時往往對產(chǎn)物合成有抑制作用。實驗涉及的玉米漿替代質(zhì)量分數(shù),在發(fā)酵液中溶磷質(zhì)量濃度達30 mg/L,是否對菌體生長或產(chǎn)物合成造成影響尚不很明確[7,12],基于此,用K2HPO4·3H2O并選擇質(zhì)量濃度30 mg/L和50 mg/L,做搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),考察磷酸鹽質(zhì)量濃度對發(fā)酵效價的影響,結(jié)果(x±s)見圖2。由圖2數(shù)據(jù)顯示:發(fā)酵配方中加入質(zhì)量濃度50 mg/L的K2HPO4·3H2O,對發(fā)酵效價無顯著性影響,t檢驗P=0.82。

圖2 磷酸鹽質(zhì)量濃度對發(fā)酵效價的影響Fig.2 Effect of phosphate mass concentration on fermentation titer

2.3 碳、氮源優(yōu)化

由于葡萄糖的分解比氨基酸復雜,過程也緩慢,菌體最初階段利用的碳不是來自糖而是來自蛋白質(zhì)的碳架,所以氮源對菌體濃度有更大的影響,并可能進一步影響初級代謝向次級代謝的轉(zhuǎn)化進程。碳源氮源雖然都可用于構(gòu)成微生物菌體及各種初級和次級代謝產(chǎn)物,但碳源的主要功能是為微生物中后期的生長代謝提供能量,兩者在功能上有區(qū)別,即便同一產(chǎn)品不同控制條件下的發(fā)酵生產(chǎn)對碳氮比的要求也不同。微生物發(fā)酵是具有生命特征的高度復雜系統(tǒng)的連鎖反應,高效的合成路線受到嚴密而精確的多層信號調(diào)控,任何一個條件的變化,都會引起系列的反應。玉米漿部分替代黃豆餅不僅是氮源種類及數(shù)量的變化,還涉及碳源及碳氮平衡?；诖?綜合考慮有關因素,在其他原料配比不變情況下,按表1所列的因素、水平,搖瓶發(fā)酵對玉米漿、黃豆餅粉、淀粉和硫酸銨設計了擬水平L9(34)正交試驗(表2),確定最優(yōu)水平組合。根據(jù)極差R大小,確定4個因素對效價影響的主次順序,黃豆餅粉>淀粉>玉米漿>硫酸銨。根據(jù)k值確定4因素最優(yōu)水平組為A3B3C1D1,即質(zhì)量濃度分別為淀粉174 g/L,玉米漿3.1 g/L,黃豆餅粉21 g/L,硫酸銨0.3 g/L。

表1 正交設計因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal design factors

① 淀粉;② 玉米漿;③ 黃豆餅粉;④ 硫酸銨。

表2 擬水平L9(34)正交試驗Table 2 Orthogonal test of quasi-horizontal L9(34)

① 為運算方便,測定效價值應減去5 000;② 為1水平的擬水平。

為精確計算黃豆餅粉、淀粉、玉米漿和硫酸銨對發(fā)酵效價的影響程度,對表2做方差分析,結(jié)果見表3。由表3數(shù)據(jù)顯示:黃豆餅粉和淀粉的P值均小于0.05,對效價有顯著的影響。硫酸銨均方(MS=32 598)<誤差e均方(MS=172 721),將硫酸銨的MS與誤差e的MS合并為新均方e△[13]。由于蛋白質(zhì)是高分子化合物,其相對分子量從幾萬到幾千萬,必須水解為小分子的氨基酸才能被菌體吸收利用,因為20種氨基酸的平均分子量128,接近于硫酸銨的分子量132.14,所以玉米漿中氨基酸,可作為速效的有機氮源,替代無機氮源硫酸銨。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

玉米漿P>0.05,僅表示在設計水平(2.9～3.1 g/L)內(nèi)玉米漿質(zhì)量濃度的變化對效價的影響不顯著。隨著替代質(zhì)量分數(shù)的增加,對效價影響程度增強,因為相同數(shù)量的氮源較碳源對菌量的形成有更大的影響,對于菌絲“成球”的阿維鏈霉菌發(fā)酵,氮源質(zhì)量濃度的控制尤其重要,畢然[14]曾研究了各種氮源物質(zhì)對阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素的影響。高質(zhì)量濃度的氮源將導致發(fā)酵液黏度過高,菌體代謝異常,效價增長緩慢,這時往往需要從發(fā)酵控制上做相應的調(diào)整,以盡可能的減少生產(chǎn)損失。

由于正交試驗得到的最優(yōu)方案不在試驗序列中,需將優(yōu)化后的方案A3B3C1與第9號A3B3C2D1試驗做搖瓶發(fā)酵對照比較。將培養(yǎng)好的種子液接入不同配方的試驗組和對照組,每組接3瓶。結(jié)果(平均值±標準差)為試驗組效價=(7 984±153) μg/mL,對照組效價=(7 862±138) μg/mL,試驗組較對照組高1.5%。這是由于優(yōu)化后的方案和9號試驗的碳源質(zhì)量濃度相同(淀粉質(zhì)量濃度為174 g/L),而優(yōu)方案黃豆餅粉質(zhì)量濃度為21 g/L,第9號試驗黃豆餅粉質(zhì)量濃度23 g/L,即優(yōu)方案的碳氮比更高,可以減緩菌絲的衰老,有益于發(fā)酵后期效價的持續(xù)增長。微生物細胞可以通過感應環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度調(diào)節(jié)細胞行為。劉樂詩等[15]研究發(fā)現(xiàn):當碳源豐富時微生物細胞會大量的攝入而且高效經(jīng)濟的選擇以三酰甘油的形式囤積在細胞體內(nèi),在儲存了大量碳源的同時又存儲了大量還原力,為阿維鏈霉菌在發(fā)酵后期阿維菌素的生物合成提供更多的能量支持。

2.4 優(yōu)化配方的驗證

將優(yōu)化后的配方與原配方進行優(yōu)化前后效價、生物質(zhì)量分數(shù)的變化情況進行考察。在100 L發(fā)酵罐上,做了5個批次的平行實驗,優(yōu)化前后放罐效價比較見圖3,生物質(zhì)量分數(shù)比較見圖4。結(jié)果顯示:配方優(yōu)化前后,兩者均無顯著性差異,t檢驗,p效價=0.96,p生物質(zhì)量分數(shù)=0.66,即玉米漿部分替代黃豆餅粉,在減少發(fā)酵費用的同時,效價和生物質(zhì)量分數(shù)不受影響,降低了阿維菌素的生產(chǎn)成本。

圖3 優(yōu)化前后放罐效價比較Fig.3 Comparison of tank titer before and after optimization

圖4 優(yōu)化前后生物質(zhì)量分數(shù)比較Fig.4 Comparison of biomass before and after optimization

3 結(jié) 論

微生物生長離不開環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì),通常的配方設計中即有速效氮源又有緩效氮源,以滿足菌體在發(fā)酵不同時期生長繁殖的需要,達到生長期縮短,產(chǎn)抗期延長的目的。黃豆餅粉作為緩效氮源,發(fā)酵過程中在蛋白酶的精確調(diào)控下適時、適量的水解為小分子的氨基酸,滿足其在發(fā)酵中后期的需要。玉米漿作為速效有機氮源用于菌體發(fā)酵前期生長繁殖,從功能上講,玉米漿不宜完全替代黃豆餅粉。實驗結(jié)果顯示:玉米漿對減少的黃豆餅粉替代質(zhì)量分數(shù)為50%,在作用上,1個質(zhì)量單位的玉米漿等效于2個質(zhì)量單位黃豆餅粉。使用玉米漿部分替代黃豆餅粉,可以提高玉米漿附加值,實現(xiàn)循環(huán)利用,低碳發(fā)展的目標。與原配方比較,在減少黃豆餅粉用量的同時,不影響發(fā)酵效價,能夠降低阿維菌素生產(chǎn)成本。