李國華,熊海波,梅漫莉,陳 寧,2,徐慶陽,2

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457;2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津 300457)

現(xiàn)有氨基酸發(fā)酵過程中為了減少底物抑制,提高發(fā)酵生產(chǎn)效率和提高設(shè)備利用率,大多進(jìn)行分批補料發(fā)酵,在發(fā)酵過程中及時的根據(jù)工藝需求向發(fā)酵罐內(nèi)補充氨水、氫氧化鈉、葡萄糖或其他營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。重組大腸桿菌雖然作為重要的工業(yè)微生物被廣泛應(yīng)用于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域,但是大腸桿菌環(huán)境抗逆性差[3-4],對環(huán)境變化敏感。當(dāng)前氨基酸發(fā)酵罐補料大多從發(fā)酵罐頂部單股注入(大型發(fā)酵罐罐從風(fēng)管道流加液氨),在發(fā)酵罐(特別是大型發(fā)酵罐)中由于傳質(zhì)能力的限制[5-6],極易造成局部糖液濃度過大,引起局部糖濃度過高和局部供糖不足,引起乙酸等其他雜酸生成[7-8]。因為發(fā)酵罐傳質(zhì)能力限制[9-10],引起發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH梯度或者底物濃度梯度現(xiàn)象,往往會引起工程師判斷失誤,嚴(yán)重的降低了發(fā)酵控制水平,造成生化反應(yīng)速度變慢、發(fā)酵周期延長、糖酸轉(zhuǎn)化率低和浪費嚴(yán)重等后果[11]。為解決上述問題,有必要研發(fā)一種新型的能夠改善發(fā)酵補料過程傳質(zhì)效率的裝置或設(shè)備。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌 種

L-酪氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌TYR-03,天津科技大學(xué)代謝工程實驗室提供。

1.1.2 主要設(shè)備

2T機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐,無錫市宜欣制藥設(shè)備廠;200 L二級種子罐,鎮(zhèn)江東方生物設(shè)備技術(shù)有限公司;30 L一級種子罐,鎮(zhèn)江東方生物設(shè)備技術(shù)有限公司;SBA-40ES生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;S-433D全自動氨基酸分析儀,賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司,ABER活細(xì)胞在線分析儀,艾利特國際貿(mào)易(香港)有限公司。

1.1.3 示 蹤 劑

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.99%的高純度氯化鉀配置成1 mol/L的氯化鉀溶液。

1.1.4 培 養(yǎng) 基

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖30 g/L,酵母粉5 g/L,硫酸銨4 g/L,磷酸二氫鉀3 g/L,七水硫酸鎂2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,苯丙氨酸0.5 g/L,一水硫酸錳1.2 mg/L,七水硫酸亞鐵5 mg/L,VH1 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖18 g/L,酵母粉5 g/L,硫酸銨5 g/L,磷酸二氫鉀4 g/L,七水硫酸鎂2 g/L,谷氨酸0.1 g/L,一水檸檬酸2 g/L,甲硫氨酸1 g/L,苯丙氨酸0.5 g/L,一水硫酸錳10 mg/L,七水硫酸亞鐵30 mg/L,VH1 mg/L。

另外,在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中各添加VBX0.5 mL/L,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素混合液1.5 mL/L。其中VBX為維生素B1,B3,B5,B7,B12等比例配制成10 mg/mL的混合液。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合效果的測定

采用1 mol/L的氯化鉀溶液作為示蹤劑,按照1%體積比加入裝有去離子水中發(fā)酵罐中,控制發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100 r/min,通風(fēng)流量4 m3/h,溫度36 ℃,裝填系數(shù)60%,對照組從罐頂補料口加入發(fā)酵罐,實驗組利用噴霧補料裝置迅速加入發(fā)酵罐。活細(xì)胞在線分析儀[12]插入發(fā)酵罐中部的溶氧電極插口,用活細(xì)胞在線分析儀測量電導(dǎo)率的功能來獲取發(fā)酵罐中電導(dǎo)率隨時間的變化規(guī)律。

1.2.2 菌種活化

從-80 ℃冰箱取出保菌管,用接種環(huán)接種并均勻涂布在固體LB試管斜面培養(yǎng)基上,36 ℃培養(yǎng)12 h至斜面布滿菌苔,然后把試管斜面菌苔用接種環(huán)接種并均勻在2個裝有固體LB斜面培養(yǎng)基的500 mL茄形瓶中,36 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.3 種子擴(kuò)培

用無菌水洗下茄形瓶中的菌苔,火焰接種于一級種子罐,36 ℃培養(yǎng)8 h左右至生物量OD60020,并按照10%的體積比壓差接種于二級種子罐,36 ℃進(jìn)行二級種子培養(yǎng),種子培養(yǎng)過程中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%氨水調(diào)節(jié)pH 7.0,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通風(fēng)流量控制溶氧20%以上。

1.2.4 發(fā) 酵

二級種子培養(yǎng)至生物量OD60020,壓差接種于發(fā)酵罐,36 ℃開始分批補料發(fā)酵。發(fā)酵過程中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%氨水調(diào)節(jié)pH 7.0,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通風(fēng)流量控制溶氧,流加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)60%的葡萄糖控制發(fā)酵液殘?zhí)?～5 g/分批補料發(fā)酵。

對照組:氨水和流加葡萄糖從發(fā)酵罐頂部補料口單股注入;實驗組:使用噴霧補料裝置注入發(fā)酵罐。

1.2.5 生物量的測定

采用比濁法估計生物量[13],即用分光光度計測量600 nm波長條件下檢測發(fā)酵液吸光度,必要時發(fā)酵液適當(dāng)稀釋至0.2～0.8的范圍,其生物量=吸光度×稀釋倍數(shù)。

1.2.6 有機(jī)酸(雜酸)濃度的測定

采用氨基酸分析儀和示差液相分析儀進(jìn)行測定[14-15]。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗平均3次,采用Excel和OriginPro 2018c進(jìn)行計算并繪圖,顯著性分析置信水平P=0.05;發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)圖采用AutoCAD 2016進(jìn)行繪制。

2 設(shè)計方案和工作過程

2.1 設(shè)計方案

一種發(fā)酵罐噴霧補料裝置,包括第一管道、第二管道、第三管道、流量計、第一壓力表、空氣濾膜、第四管道、文丘里管[12]、無菌空氣閥、高壓蒸汽閥、補料閥、頂部進(jìn)料閥和底部進(jìn)料閥(圖1)。如圖1所示,第三管道左端經(jīng)無菌空氣閥與第一管道連通、經(jīng)高壓蒸汽閥與第二管道連通,右端經(jīng)空氣濾膜與文丘里管連通,文丘里管下部經(jīng)補料閥與第四管道連通,文丘里管右端經(jīng)三通后分為兩管道分別經(jīng)頂部進(jìn)料閥和底部進(jìn)料閥進(jìn)入發(fā)酵罐,發(fā)酵罐內(nèi)設(shè)的頂部分布器左端與頂部進(jìn)料閥相連,發(fā)酵罐內(nèi)設(shè)的底部分布器左端與底部進(jìn)料閥相連。

1—第一管道;2—第二管道;3—第三管道;4—流量計;5—第一壓力表;6—空氣濾膜;7—第四管道;8—文丘里管;9—支撐架;10—第二壓力表;11—第五管道;12—頂部分布器;13—噴頭;14—底部分布器;K1—無菌空氣閥;K2—高壓蒸汽閥;K3—補料閥;K4—頂部進(jìn)料閥;K5—底部進(jìn)料閥;K6—尾氣閥。圖1 發(fā)酵罐噴霧補料裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Fermenter structural diagram of a spray apparatus feeding

文丘里管左端經(jīng)過空氣濾膜接通無菌空氣,下部經(jīng)過補料閥接通補料罐、右端經(jīng)分布器進(jìn)入發(fā)酵罐,無菌空氣經(jīng)文丘里管流速變大、氣壓變小,待補加料液經(jīng)文丘里管迅速稀釋和霧化。

發(fā)酵罐的罐體內(nèi)設(shè)有罐體攪拌器,發(fā)酵罐還包括支撐架、第二壓力表、第五管道、頂部分布器、底部分布器和尾氣閥,其中發(fā)酵罐的罐體外部頂端安裝有第二壓力表和第五管道,第五管道上設(shè)置有尾氣閥。圖1頂部分布器通過支撐架與罐體焊接固定懸掛于發(fā)酵罐內(nèi)部頂端,底部分布器通過四根支撐架與罐體焊接固定,支撐架通過四根支撐架托舉底部分布器于發(fā)酵罐內(nèi)部的底部。

圖2為沿圖1中A-A線和B-B線的截面示意圖。頂部分布器和底部分布器均為環(huán)形圓管,下部開孔接通多個噴頭,可以使料液進(jìn)一步分散和物化,以噴霧方式進(jìn)入發(fā)酵罐。第一管道、第二管道和第四管道上分別接通無菌空氣、高壓蒸汽和補料瓶/罐。發(fā)酵罐噴霧補料裝置,第三管道的管道上部分別接通流量計和第一壓力表。

圖2 截面示意圖Fig.2 Schematic section

2.2 工作過程

2.2.1 滅菌過程

如圖1,2所示,滅菌時應(yīng)無菌空氣閥K1、補料閥K3關(guān)閉,高壓蒸汽閥K2、頂部進(jìn)料閥K4和底部進(jìn)料閥K5打開,高壓蒸汽從第二管道2,對第三管道、空氣濾膜6、文丘里管8、頂部進(jìn)料閥K4、底部進(jìn)料閥K5、頂部分布器12、底部分布器14、噴頭13、發(fā)酵罐罐體、第五管道11、尾氣閥K6及培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌,滅菌過程注意監(jiān)控第一壓力表與第二壓力表示數(shù),控制各閥開閉。

2.2.2 通風(fēng)過程

如圖1,2所示,通風(fēng)時應(yīng)高壓蒸汽閥K2、補料閥K3關(guān)閉,無菌空氣閥1、底部進(jìn)料閥K5、頂部進(jìn)料閥K4和尾氣閥K6打開,無菌空氣依次從第一管道1、無菌空氣閥K1、第三管道3、空氣濾膜6文丘里管8、頂部進(jìn)料閥K4、底部進(jìn)料閥K5、頂部分布器12、底部分布器14和噴頭13,進(jìn)入發(fā)酵罐用于霧化物料、保持正壓和為發(fā)酵提供氧氣,最后尾氣經(jīng)尾氣閥K6從第五管道11排出。通氣過程中觀察壓力表和流量計,調(diào)整各閥開閉程度。

2.2.3 補料過程

圖3為分布器噴霧補料示意圖。補料時應(yīng)高壓蒸汽閥K2關(guān)閉,無菌空氣閥1、補料閥K3、頂部進(jìn)料閥K4、底部進(jìn)料閥K5和尾氣閥K6打開,補加料液經(jīng)補料閥進(jìn)入文丘里管8被高速無菌空氣初步霧化,可以經(jīng)頂部或底部單獨或同時經(jīng)過頂部進(jìn)料閥K4、底部進(jìn)料閥K5進(jìn)入分布器見圖3(a),在經(jīng)過噴頭13二次霧化,噴入發(fā)酵罐見圖3(b),進(jìn)行補料。發(fā)酵尾氣經(jīng)第五管道和尾氣閥K6排出,觀察壓力表和流量計,調(diào)整各閥開閉程度。

圖3 分布器噴霧補料示意圖Fig.3 Distributor spray repair material

3 實驗驗證

為驗證該裝置設(shè)計的可行性,對2T機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐進(jìn)行適當(dāng)改造,并通過測定混合效果和酪氨酸發(fā)酵實驗進(jìn)而驗證噴霧補料裝置強(qiáng)化傳質(zhì)的能力。

3.1 混合效果實驗

一定量的電解質(zhì)(氯化鉀)溶液[14-16]加入到裝有去離子水的發(fā)酵罐中,經(jīng)過一定時間的擴(kuò)散運動,氯化鉀電離后以離子形態(tài)會從發(fā)酵罐溶液的局部逐漸分散混合到整個發(fā)酵罐,最終氯化鉀的的均相溶液,發(fā)酵罐中溶液的電導(dǎo)率從低水平上升到高水平[17-18],記從0 mS/m到電導(dǎo)率最大值的90%所用的時間為混合時間。發(fā)酵罐的傳質(zhì)能力強(qiáng)弱與混合時間長短呈反相關(guān),即混合時間越短,發(fā)酵罐混合效果越好、傳質(zhì)能力越強(qiáng);混合時間越長,發(fā)酵罐混合效果越差、傳質(zhì)能力越弱。

圖4為對照組和實驗組以氯化鉀為示蹤劑注入發(fā)酵罐后電導(dǎo)率變化。由圖4可知:對照組和實驗組以不同方式在設(shè)定條件下加入氯化鉀后電導(dǎo)率逐漸由0 mS/m(低水平)升高到13.23 mS/m(高水平14.7 mS/m的90%),實驗組(A點)混合時間12 s,對照組(B點)混合時間14.8 s,實驗組比對照組混合時間同比減少23.3%。這是因為采用噴霧補料裝置的實驗組在補加氯化鉀溶液時從發(fā)酵罐頂端分布器和底部分布器2個部位補加氯化鉀溶液,而且經(jīng)過文丘里管和噴頭對氯化鉀溶液的多級霧化和分散,使進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)能夠在較短的混合時間迅速的擴(kuò)散成均相溶液;而對照組采用從發(fā)酵罐頂部補料口單股注入氯化鉀溶液的方式,氯化鉀溶液局部質(zhì)量濃度較大,分散成均相溶液的混合時間較長。因此,初步判定采用噴霧補料裝置后能夠提高發(fā)酵罐傳質(zhì)效果,且同比提高23.3%。

圖4 發(fā)酵罐電導(dǎo)率變化Fig.4 Fermenter conductivity changes

3.2 酪氨酸發(fā)酵實驗

以大腸桿菌發(fā)酵酪氨酸為例,比較發(fā)酵罐對照組和實驗組的發(fā)酵參數(shù),并以發(fā)酵強(qiáng)度為判斷傳質(zhì)能力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn),從而驗證該裝置可以提高發(fā)酵罐的傳質(zhì)能力。圖5,6為發(fā)酵罐改造前(對照組)后(實驗組)酪氨酸質(zhì)量濃度、生物量和副產(chǎn)物(雜酸)的變化趨勢。

圖5 對照組和實驗組酪氨酸質(zhì)量濃度和生物量變化趨勢Fig.5 Tyrosine production and biomass trends before and after the transformation fermenter

圖6 對照組和實驗組雜酸變化趨勢Fig.6 Changes in trends before and after the organic acid content transformation fermenter

由圖5,6可知:實驗組采用噴霧補料裝置發(fā)酵罐在進(jìn)行酪氨酸發(fā)酵時,各項發(fā)酵指標(biāo)均有改進(jìn);達(dá)到酪氨酸最高質(zhì)量濃度42 g/L時實驗組比對照組減少用時4 h,發(fā)酵強(qiáng)度由1.5 g/(L·h)提高至1.8 g/(L·h),同比提高20%;實驗組生物量和生長速率明顯低于對照組,在發(fā)酵進(jìn)行到20 h后,對照組生物量開始大幅下降而對照組生物量基本不變,發(fā)酵結(jié)束時生物量同比提高27%。這是因為對照組發(fā)酵罐在進(jìn)行酪氨酸發(fā)酵時由于傳質(zhì)效果不好,存在pH梯度和葡萄糖梯度,造成局部氨水和葡萄糖濃度過高或過低,容易損傷菌體細(xì)胞和導(dǎo)致雜酸生成,特別是乙酸的積累,對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,造成發(fā)酵中后期細(xì)胞生長速率下降(圖5中8 h后),甚至引起細(xì)胞早衰死亡,生物量過早下降(圖5中20 h后),發(fā)酵產(chǎn)酸(L-酪氨酸)能力下降。同時,利用氨基酸分析儀和示差液相檢測發(fā)酵液中的其他有機(jī)酸(雜酸)的種類和質(zhì)量濃度,發(fā)現(xiàn)大于1 g/L的有機(jī)酸的種類沒有變化,而實驗組有機(jī)酸質(zhì)量濃度較對照組均有下降,特別是乙酸質(zhì)量濃度下降3.2倍,雜酸總質(zhì)量濃度同比下降56%,糖酸轉(zhuǎn)化率同比提高17%。這是由于實驗組發(fā)酵罐傳質(zhì)效果的提高,對細(xì)胞的發(fā)酵生產(chǎn)酪氨酸目標(biāo)代謝有積極的促進(jìn)作用,減少了雜酸的生成,使得更多的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(L-酪氨酸),有利于減少浪費,提高經(jīng)濟(jì)性能。因此,以發(fā)酵強(qiáng)度為傳質(zhì)能力的標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)過大腸桿菌發(fā)酵L-酪氨酸實驗驗證了發(fā)酵罐噴霧補料裝置能夠提高發(fā)酵罐的傳質(zhì)能力,并且傳質(zhì)能力同比提高20%。

4 結(jié) 論

設(shè)計了一種發(fā)酵罐噴霧補料裝置,將待補加料液經(jīng)過文丘里管霧化,初步分散成小液滴,通過發(fā)酵罐底部的空氣分布器或發(fā)酵罐頂?shù)姆植计鲊婎^進(jìn)行二次霧化,噴霧進(jìn)入發(fā)酵液,可以完成對發(fā)酵液的均勻補料;對2T機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐進(jìn)行改造,經(jīng)過氯化鉀溶液混合實驗和大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸實驗,證實該裝置提高發(fā)酵罐傳質(zhì)能力20%～23.3%;發(fā)酵罐噴霧補料裝置可以有效地克服由于傳質(zhì)性能差、物料混合效果差造成局部pH梯度和底物質(zhì)量濃度梯度的缺陷,提高發(fā)酵罐傳質(zhì)能力,提高生化反應(yīng)速率,減少雜酸產(chǎn)生,提高糖酸轉(zhuǎn)化率,減少浪費。