頂空氣相色譜法檢測羥基甲硝唑?qū)φ掌分械臍埩羧軇?/h1>
2020-07-15 09:03馬秋冉楊秀玉張秀英于曉輝
中國獸藥雜志 2020年6期
馬秋冉，楊 星，楊秀玉，張秀英，于曉輝
(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)
甲硝唑是畜牧生產(chǎn)中常用的一種硝基咪唑類藥物，此類藥物能殺滅和預(yù)防厭氧菌及病原蟲，可用于治療與預(yù)防滴蟲病、球蟲病及各種厭氧菌感染[1]。由于甲硝唑含有的硝基雜環(huán)類化合物存在細(xì)胞誘變性，因此，具有潛在的動(dòng)物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，其藥物殘留對動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成了直接威脅[2]。為保證食品安全，我國對動(dòng)物性食品中甲硝唑及其代謝物羥基甲硝唑進(jìn)行殘留量監(jiān)控。在現(xiàn)行的殘留監(jiān)控檢測標(biāo)準(zhǔn)中[3-7]，需使用羥基甲硝唑?qū)φ掌罚壳皣鴥?nèi)未見供應(yīng)，因此，制備該對照品以滿足行業(yè)需求。采用質(zhì)量平衡法對羥基甲硝唑?qū)φ掌愤M(jìn)行定值研究，需分別測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有關(guān)物質(zhì)、水分、殘留溶劑及無機(jī)雜質(zhì)的含量。羥基甲硝唑?qū)φ掌吩谏a(chǎn)工藝中用到了甲醇和丙酮，因此，確定甲醇和丙酮為殘留溶劑測定目標(biāo)。本文參考文獻(xiàn)中甲醇和丙酮的殘留溶劑測定方法[8-10]，建立了頂空毛細(xì)管氣相色譜法檢測羥基甲硝唑?qū)φ掌分械臍埩羧軇?，并進(jìn)行方法學(xué)研究，最終采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對其殘留溶劑進(jìn)行含量測定。
1 材料與方法
1.1 儀器 7890A氣相色譜儀(包括7697A型頂空進(jìn)樣器，安捷倫科技公司)；XS205電子天平(Mettler Toledo公司，感量0.1 mg)；頂空進(jìn)樣瓶(20 mL，安捷倫科技公司)。
1.2 試劑 甲醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(Thermo Fisher公司，色譜純)。
1.3 試藥 羥基甲硝唑(成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所制備，批號160815)。
1.4 色譜條件 色譜柱為Agilent DB-624石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；程序升溫：起始溫度為30 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；氫火焰離子化檢測器(FID)溫度為250 ℃；載氣為高純氮?dú)?，流量? mL/min，分流比為5∶1。
1.5 頂空進(jìn)樣器條件 頂空瓶平衡溫度為80 ℃，頂空瓶體積為20 mL，供試的溶液體積為1 mL，平衡時(shí)間為30 min；定量環(huán)溫度為90 ℃；傳輸線溫度為105 ℃，分流比為1∶5。
1.6 溶液的制備
1.6.1 混合對照品溶液 取甲醇約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為甲醇對照品儲備液；取丙酮約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為丙酮對照品儲備液；精密量取甲醇對照品儲備液0.3 mL、丙酮對照品儲備液0.5 mL，置同一10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，配制成含甲醇300 μg/mL和丙酮500 μg/mL的混合對照品溶液。
1.6.2 供試品溶液 取羥基甲硝唑0.5 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含羥基甲硝唑0.1 g/mL的供試品溶液。
1.6.3 空白溶液 N,N-二甲基甲酰胺為空白溶液。
1.6.4 檢測限與定量限試驗(yàn)溶液 分別取甲醇和丙酮對照品儲備液，逐級稀釋為4、3、2、1、0.5 μg/mL甲醇對照品溶液，及3、2、1、0.5、0.25 μg/mL丙酮對照品溶液。
1.6.5 線性與范圍試驗(yàn)溶液 分別取甲醇和丙酮對照品儲備液，配制2、30、120、240、300、360 μg/mL的甲醇對照品溶液，及1、50、200、400、500、600 μg/mL的丙酮對照品溶液。
1.6.6 回收率試驗(yàn)溶液 取羥基甲硝唑0.1 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，用1 mL相當(dāng)于混合對照品溶液濃度80%，100%，120%的含各溶劑的溶液(80%對照品溶液中甲醇濃度為240 μg/mL，丙酮濃度為400 μg/mL；100%對照品溶液中甲醇濃度為300 μg/mL，丙酮濃度為500 μg/mL；120%對照品溶液中甲醇濃度為360 μg/mL，丙酮濃度為600 μg/mL。)溶解，每個(gè)濃度點(diǎn)制備3份，作為回收率試驗(yàn)溶液。
2 結(jié)果與分析
2.1 專屬性 分別精密量取空白溶液和混合對照品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，甲醇、丙酮的保留時(shí)間分別為4.478、7.718 min，空白溶劑N,N-二甲基甲酰胺的保留時(shí)間為16.840 min。甲醇、丙酮，N,N-二甲基甲酰胺分離度均大于1.5。表明頂空進(jìn)樣條件能夠?qū)⒓状己捅浞指患?，色譜分離條件能夠有效分離甲醇、丙酮，且N,N-二甲基甲酰胺對測定結(jié)果無影響，具有較好的專屬性。
1:甲醇(methanol) 2:丙酮(acetion)圖1 空白溶液(A)與混合對照品溶液(B)的氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms of blank solution(A) and substances solution(B)
2.2 檢測限與定量限 分別精密量取甲醇和丙酮的檢測限與定量限試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比大于等于3∶1時(shí)的濃度為檢測限，信噪比大于等于10∶1時(shí)的濃度為定量限，考察甲醇與丙酮的檢測限和定量限。結(jié)果顯示，甲醇檢測限為1.0 μg/mL，定量限為2.0 μg/mL；丙酮檢測限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。
2.3 線性與范圍 分別精密量取甲醇和丙酮的線性與范圍試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積與對照品濃度作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，甲醇在2～360 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=1807.5X-3.0667，相關(guān)系數(shù)r=0.9996；丙酮在1.0～600 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=4754.3X+3.3266，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。
2.4 精密度(重復(fù)性) 精密量取混合對照品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，平行制備6份，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，甲醇和丙酮峰面積的RSD分別為0.3%和0.4%(表1)。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 The results of precision test(n=6)
2.5 準(zhǔn)確度 分別精密量取各濃度回收率試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對殘留溶劑進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，甲醇回收率為98.0%～102.4%，RSD為0.6%～0.9%；丙酮回收率為97.0%～99.6%，RSD為0.6%～1.0%。表明兩者均具有較好的回收率(表2)。
2.6 樣品的測定 精密量取供試品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，平行制備4份，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，羥基甲硝唑中殘留溶劑量分別為甲醇0.04%，丙酮0.01%(表3)。
表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of recovery test
表3 羥基甲硝唑殘留溶劑測定結(jié)果Tab 3 The results of residual organic solvents testing of hydroxy metronidazole
3 討論與結(jié)論
在性狀考察中發(fā)現(xiàn)，羥基甲硝唑在水中幾乎不溶，此種情況下可選用N,N-二甲基甲酰胺(或二甲亞砜)作為溶劑。經(jīng)試驗(yàn)表明羥基甲硝唑在N,N-二甲基甲酰胺和二甲亞砜中溶解性好，且兩種溶劑對待測組分均無干擾。但二甲亞砜比N,N-二甲基甲酰胺在柱中的保留時(shí)間長，所以為縮短分析時(shí)間，最終選擇N,N-二甲基甲酰胺作為試驗(yàn)溶劑。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用直接進(jìn)樣法進(jìn)行測定，雖操作簡便，但有未知峰干擾甲醇測定，改變載氣流速、程序升溫方式、色譜柱等條件，均不能將兩者有效分離，考慮可能是樣品中含有不揮發(fā)性組分所造成。后改用頂空進(jìn)樣法進(jìn)行測定，未見未知峰干擾甲醇、丙酮的測定。該方法可有效避免未知物的干擾，且簡便，干凈，快速，儀器自動(dòng)化程度高，可作為殘留溶劑測定首選方法。
頂空進(jìn)樣法測定殘留溶劑時(shí)，平衡條件對試驗(yàn)結(jié)果影響很大。為確定最佳平衡條件，分別對平衡溫度60、70、80、90 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果表明同一濃度試液在上述不同平衡溫度下，各待測物的峰面積在80 ℃時(shí)達(dá)到最大且保持穩(wěn)定。確定平衡溫度80 ℃后，又對平衡時(shí)間10、20、30、40 min進(jìn)行考察，結(jié)果表明同一濃度試液在上述不同平衡時(shí)間下，各待測物的峰面積在平衡時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大且保持穩(wěn)定，即各待測組分達(dá)到了氣液兩相平衡。因此，最終確定平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min。
本試驗(yàn)采用頂空氣相色譜法，對羥基甲硝唑?qū)φ掌分屑状肌⒈獌煞N有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行測定，該方法分離度、精密度和回收率等指標(biāo)均能達(dá)到《中國獸藥典》[11]中有機(jī)溶劑殘留量測定法的要求，可用于羥基甲硝唑?qū)φ掌分屑状?、丙酮?dú)埩袅康臋z測，也可為其他藥物中甲醇、丙酮?dú)埩袅康臋z測提供參考。
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1 材料與方法
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1.5 頂空進(jìn)樣器條件 頂空瓶平衡溫度為80 ℃，頂空瓶體積為20 mL，供試的溶液體積為1 mL，平衡時(shí)間為30 min；定量環(huán)溫度為90 ℃；傳輸線溫度為105 ℃，分流比為1∶5。
1.6 溶液的制備
1.6.1 混合對照品溶液 取甲醇約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為甲醇對照品儲備液；取丙酮約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為丙酮對照品儲備液；精密量取甲醇對照品儲備液0.3 mL、丙酮對照品儲備液0.5 mL，置同一10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，配制成含甲醇300 μg/mL和丙酮500 μg/mL的混合對照品溶液。
1.6.2 供試品溶液 取羥基甲硝唑0.5 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含羥基甲硝唑0.1 g/mL的供試品溶液。
1.6.3 空白溶液 N,N-二甲基甲酰胺為空白溶液。
1.6.4 檢測限與定量限試驗(yàn)溶液 分別取甲醇和丙酮對照品儲備液，逐級稀釋為4、3、2、1、0.5 μg/mL甲醇對照品溶液，及3、2、1、0.5、0.25 μg/mL丙酮對照品溶液。
1.6.5 線性與范圍試驗(yàn)溶液 分別取甲醇和丙酮對照品儲備液，配制2、30、120、240、300、360 μg/mL的甲醇對照品溶液，及1、50、200、400、500、600 μg/mL的丙酮對照品溶液。
1.6.6 回收率試驗(yàn)溶液 取羥基甲硝唑0.1 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，用1 mL相當(dāng)于混合對照品溶液濃度80%，100%，120%的含各溶劑的溶液(80%對照品溶液中甲醇濃度為240 μg/mL，丙酮濃度為400 μg/mL；100%對照品溶液中甲醇濃度為300 μg/mL，丙酮濃度為500 μg/mL；120%對照品溶液中甲醇濃度為360 μg/mL，丙酮濃度為600 μg/mL。)溶解，每個(gè)濃度點(diǎn)制備3份，作為回收率試驗(yàn)溶液。
2 結(jié)果與分析
2.1 專屬性 分別精密量取空白溶液和混合對照品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，甲醇、丙酮的保留時(shí)間分別為4.478、7.718 min，空白溶劑N,N-二甲基甲酰胺的保留時(shí)間為16.840 min。甲醇、丙酮，N,N-二甲基甲酰胺分離度均大于1.5。表明頂空進(jìn)樣條件能夠?qū)⒓状己捅浞指患?，色譜分離條件能夠有效分離甲醇、丙酮，且N,N-二甲基甲酰胺對測定結(jié)果無影響，具有較好的專屬性。
1:甲醇(methanol) 2:丙酮(acetion)圖1 空白溶液(A)與混合對照品溶液(B)的氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms of blank solution(A) and substances solution(B)
2.2 檢測限與定量限 分別精密量取甲醇和丙酮的檢測限與定量限試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比大于等于3∶1時(shí)的濃度為檢測限，信噪比大于等于10∶1時(shí)的濃度為定量限，考察甲醇與丙酮的檢測限和定量限。結(jié)果顯示，甲醇檢測限為1.0 μg/mL，定量限為2.0 μg/mL；丙酮檢測限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。
2.3 線性與范圍 分別精密量取甲醇和丙酮的線性與范圍試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積與對照品濃度作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，甲醇在2～360 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=1807.5X-3.0667，相關(guān)系數(shù)r=0.9996；丙酮在1.0～600 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=4754.3X+3.3266，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。
2.4 精密度(重復(fù)性) 精密量取混合對照品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，平行制備6份，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，甲醇和丙酮峰面積的RSD分別為0.3%和0.4%(表1)。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 The results of precision test(n=6)
2.5 準(zhǔn)確度 分別精密量取各濃度回收率試驗(yàn)溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對殘留溶劑進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，甲醇回收率為98.0%～102.4%，RSD為0.6%～0.9%；丙酮回收率為97.0%～99.6%，RSD為0.6%～1.0%。表明兩者均具有較好的回收率(表2)。
2.6 樣品的測定 精密量取供試品溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，平行制備4份，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，羥基甲硝唑中殘留溶劑量分別為甲醇0.04%，丙酮0.01%(表3)。
表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of recovery test
表3 羥基甲硝唑殘留溶劑測定結(jié)果Tab 3 The results of residual organic solvents testing of hydroxy metronidazole
3 討論與結(jié)論
在性狀考察中發(fā)現(xiàn)，羥基甲硝唑在水中幾乎不溶，此種情況下可選用N,N-二甲基甲酰胺(或二甲亞砜)作為溶劑。經(jīng)試驗(yàn)表明羥基甲硝唑在N,N-二甲基甲酰胺和二甲亞砜中溶解性好，且兩種溶劑對待測組分均無干擾。但二甲亞砜比N,N-二甲基甲酰胺在柱中的保留時(shí)間長，所以為縮短分析時(shí)間，最終選擇N,N-二甲基甲酰胺作為試驗(yàn)溶劑。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用直接進(jìn)樣法進(jìn)行測定，雖操作簡便，但有未知峰干擾甲醇測定，改變載氣流速、程序升溫方式、色譜柱等條件，均不能將兩者有效分離，考慮可能是樣品中含有不揮發(fā)性組分所造成。后改用頂空進(jìn)樣法進(jìn)行測定，未見未知峰干擾甲醇、丙酮的測定。該方法可有效避免未知物的干擾，且簡便，干凈，快速，儀器自動(dòng)化程度高，可作為殘留溶劑測定首選方法。
頂空進(jìn)樣法測定殘留溶劑時(shí)，平衡條件對試驗(yàn)結(jié)果影響很大。為確定最佳平衡條件，分別對平衡溫度60、70、80、90 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果表明同一濃度試液在上述不同平衡溫度下，各待測物的峰面積在80 ℃時(shí)達(dá)到最大且保持穩(wěn)定。確定平衡溫度80 ℃后，又對平衡時(shí)間10、20、30、40 min進(jìn)行考察，結(jié)果表明同一濃度試液在上述不同平衡時(shí)間下，各待測物的峰面積在平衡時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大且保持穩(wěn)定，即各待測組分達(dá)到了氣液兩相平衡。因此，最終確定平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min。
本試驗(yàn)采用頂空氣相色譜法，對羥基甲硝唑?qū)φ掌分屑状肌⒈獌煞N有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行測定，該方法分離度、精密度和回收率等指標(biāo)均能達(dá)到《中國獸藥典》[11]中有機(jī)溶劑殘留量測定法的要求，可用于羥基甲硝唑?qū)φ掌分屑状?、丙酮?dú)埩袅康臋z測，也可為其他藥物中甲醇、丙酮?dú)埩袅康臋z測提供參考。
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