彭國瑞，王秀麗，彭小兵，辛凌翔，張一幟，魏 津，李 建，李旭妮，劉 博，馬 欣，李俊平，張 媛

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

目前，我國用于預防豬丹毒病的疫苗有豬丹毒活疫苗(GC42或G4T10株)，豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗，豬丹毒滅活疫苗，豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗等產(chǎn)品，有20家左右的企業(yè)生產(chǎn)，年產(chǎn)量近300批2.38億頭份。按照《中華人民共和國獸藥典》2015年版三部(以下簡稱《中國獸藥典》)，豬丹毒疫苗的效力檢驗用攻毒菌為豬丹毒絲菌強毒血清1型C43-8 株和2型C43-6株的混合菌液。常規(guī)方法制備用于疫苗效力檢驗攻毒培養(yǎng)物，需經(jīng)過菌種復蘇、菌落篩選、擴大培養(yǎng)、菌液活菌預計數(shù)、毒力測定、菌液活菌復數(shù)以及攻毒和攻毒菌液計數(shù)等多個步驟[1]，多次強毒菌種的新鮮培養(yǎng)，重復工作多，檢驗操作周期長，工作量大，而且由于攻毒菌液對環(huán)境溫度敏感，保存條件要求高，保存不當常常會導致細菌死亡，菌數(shù)降低，對檢驗工作存在較大影響。

為此，本研究將豬丹毒檢驗用菌種制成更為易于穩(wěn)定保存和使用的凍干型攻毒培養(yǎng)物，經(jīng)過一次培養(yǎng)制備，用于多批次檢驗，減少強毒的重復培養(yǎng)，以期在增強檢驗結(jié)果準確性的同時，簡化操作步驟，提升檢驗工作效率，為標準品的制備奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌種 豬丹毒絲菌血清1型CVCC43008(C43-8)株和2型CVCC43006(C43-6)株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并保存。

1.2 試劑 肉肝胃消化湯、馬丁肉湯、馬丁瓊脂培養(yǎng)基和蔗糖脫脂奶等購自北京中海生物公司，新生胎牛血清購自GIBCO公司，裂解血細胞全血由實驗室自制，豬丹毒滅活疫苗、豬丹毒活疫苗(G4T10株)為國內(nèi)兩家企業(yè)生產(chǎn)成品。

1.3 實驗動物 體重18～22 g ICR小鼠購自北京維通利華試驗動物公司。

2 方 法

2.1 復蘇培養(yǎng) 將豬丹毒凍干菌種CVCC43008株和CVCC43006株安瓿啟封后，用肉肝胃消化湯稀釋，分別劃線接種含10%血清馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。革蘭氏染色鏡檢合格后，各挑取中等大小、表面光滑圓整、呈微藍灰色露珠狀典型菌落3個，分別接種含2%裂解血細胞全血肉肝胃消化湯，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h[2]。

2.2 凍干與保存 將2株豬丹毒培養(yǎng)菌液等體積混合后，與含16%蔗糖20%脫脂奶的凍干保護劑1∶1(V∶V)混勻，2.0 mL/瓶分裝至7 mL裝量的西林瓶內(nèi)，加膠塞，入箱凍干，壓蓋，加鋁帽，制成豬丹毒凍干培養(yǎng)物，于-20 ℃醫(yī)用冷藏箱保存待檢定。

2.3 性狀觀察 肉眼觀察凍干培養(yǎng)物在瓶內(nèi)的狀態(tài)，輕輕振蕩是否易于瓶壁脫離，以及加稀釋液后的溶解情況。

2.4 純粹檢驗 隨機抽取5瓶用含10%血清馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，按《中國獸藥典》附錄3306進行純粹檢驗[3]。

2.5 真空度與剩余水分測定 -20 ℃保存18個月后，隨機取4瓶，測定真空度和剩余水分含量。

2.6 活菌計數(shù)方法 將凍干培養(yǎng)物用馬丁肉湯適當比例梯度稀釋后，用含10%血清的馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，按《中國獸藥典》附錄3405進行活菌計數(shù)。

2.7 瓶間活菌數(shù)均一性試驗 隨機取10瓶凍干培養(yǎng)物，分別進行活菌計數(shù)，比較瓶間活菌數(shù)差異。

2.8 短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響 模擬實際攻毒使用時可能短期存放的溫度條件，研究短期存放溫度對活菌數(shù)的影響。隨機取18瓶凍干培養(yǎng)物，分別在37 ℃、25 ℃、室溫(20～25 ℃)、4 ℃、簡易冰盒(隨時間溫度逐步從-20 ℃升高到-1 ℃)等溫度條件下各存放3瓶，2.5～3.0 h后進行活菌計數(shù)。

2.9 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力監(jiān)測 凍干培養(yǎng)物-20 ℃保存1、3、6、9、12、18和36個月后，分別隨機取3瓶，進行活菌計數(shù)，按照3.6×109CFU/瓶的預估活菌數(shù)，用肉肝胃消化湯將凍干培養(yǎng)物稀釋至8 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用。0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d[2]。同時進行活菌計數(shù)，確認實際攻毒劑量[4]。

2.10 在豬丹毒疫苗檢驗中的應用

2.10.1 疫苗免疫與攻毒 按照《中國獸藥典》豬丹毒滅活疫苗和豬丹毒活疫苗效力檢驗方法，將商品化豬丹毒滅活疫苗和豬丹毒活疫苗免疫小鼠，分別采用本方法和常規(guī)方法制備的攻毒培養(yǎng)物稀釋后攻擊小鼠進行效力檢驗[2]。

2.10.2 凍干培養(yǎng)物制備攻毒菌液 隨機取同批次制備保存36個月凍干培養(yǎng)物3瓶，其中1瓶進行活菌計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將第2瓶稀釋至10、8、6、4、2 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用，0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d，同時進行活菌計數(shù)，計算實際測毒小鼠1 MLD活菌數(shù)。按照測毒結(jié)果將第3瓶稀釋后制成攻毒菌液攻毒，同時進行活菌計數(shù)，計算實際攻毒劑量。

2.10.3 常規(guī)培養(yǎng)制備攻毒菌液 開啟豬丹毒絲菌C43008株和C43006株菌種各1支，肉肝胃消化湯溶解后，劃線接種含10%血清馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取表面圓整光滑，呈微藍灰色露珠狀的菌落，兩菌株分別接種含2%裂解血細胞全血的肉肝胃消化湯37 ℃培養(yǎng)18 h，等體積混勻，3 mL/支分裝，-70 ℃凍存(需在21 d內(nèi)使用)。保存3 d后，取1支進行活菌計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，另取1支稀釋至10、8、6、4、2 CFU/0.2mL，冰浴保存，在2 h內(nèi)使用，0.2 mL/只腹股溝皮下注射體重18～22 g ICR小鼠各5只，觀察7 d，同時進行活菌計數(shù)，計算實際測毒小鼠1 MLD活菌數(shù)。按照測毒結(jié)果將第3支凍存菌稀釋制成攻毒菌液攻毒，同時進行活菌計數(shù)，計算實際攻毒劑量。

3 結(jié)果與分析

3.1 性狀觀察 凍干培養(yǎng)物為海綿狀團塊，較易與瓶壁脫離，加馬丁肉湯振搖后2 min內(nèi)溶解。

3.2 純粹檢查 用馬丁肉湯溶解后按照表1所示接種培養(yǎng)基，在25 ℃、37 ℃培養(yǎng)5 d，結(jié)果5/5純粹生長。

表1 純粹檢驗結(jié)果Tab 1 The results of purity test

“-”純粹生長；“+”有雜菌生長；“×”不生長

3.3 真空度與剩余水分測定 凍干培養(yǎng)物真空度測定合格率98.2%。36個月后抽取4瓶真空度檢驗4/4合格，測定剩余水分含量分別為2.7%、1.9%、2.5%和3.2%。

3.4 瓶間活菌數(shù)均一性試驗 10瓶凍干培養(yǎng)物平均活菌數(shù)為3.8×109CFU，變異系數(shù)(C.V)為10.0%(表2)。

表2 均一性試驗結(jié)果Tab 2 The results of uniformity test

3.5 短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響 凍干培養(yǎng)物在37 ℃條件下平均活菌數(shù)較低為2.4×109CFU。在25 ℃、室溫、4 ℃、簡易冰盒、-20 ℃等條件下較為穩(wěn)定，變異系數(shù)(C.V)為4.9%(表3)。

表3 短期存放條件對活菌數(shù)的影響Tab 3 The effect of different storage environment on viable count

3.6 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力監(jiān)測 在監(jiān)測期內(nèi)凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)較為穩(wěn)定，保存12個月變異系數(shù)為3.9%，36個月變異系數(shù)為9.1%(表4)。

表4 低溫長期保存活菌數(shù)和毒力的變化Tab 4 The changes of viable count and virulence in low temperature storage environment

3.7 在豬丹毒疫苗效力檢驗中的應用

3.7.1 測毒結(jié)果 表5所示，本方法制備的凍干培養(yǎng)物小鼠1 MLD含活菌數(shù)為5 CFU，常規(guī)方法為4 CFU。

3.7.2 檢驗結(jié)果 表6所示，本方法與常規(guī)方法制備的攻毒培養(yǎng)物應用于疫苗檢驗結(jié)果一致。

表5 豬丹毒疫苗效力檢驗測毒結(jié)果Tab 5 The results of toxicity test in potency testing of Erysipelas Bacterins

表6 豬丹毒疫苗效力檢驗結(jié)果Tab 6 The results of potency testing of Erysipelas Bacterins

4 討論與結(jié)論

本研究將疫苗檢驗用豬丹毒絲菌CVCC43008株和CVCC43006株培養(yǎng)物混合制成凍干型攻毒制劑，通過短時間存放溫度對活菌數(shù)的影響實驗，模擬了實際攻毒稀釋前培養(yǎng)物可能短期存放的環(huán)境溫度和條件，其活菌數(shù)在25 ℃、室溫、4 ℃、簡易冰盒、-20 ℃等條件下均較為穩(wěn)定。因此，該凍干培養(yǎng)物在使用時不應暴露于高溫環(huán)境，盡量在恒溫較低溫度條件下保存并使用。同時，這種凍干培養(yǎng)物在一定時間內(nèi)可以長期穩(wěn)定保存，經(jīng)活菌數(shù)和毒力監(jiān)測，能夠滿足檢驗攻毒使用，將其應用于豬丹毒疫苗的效力檢驗，多批次檢驗使用一次培養(yǎng)菌液，大大減少了強毒的重復培養(yǎng)，避免了攻毒菌液不易保存、細菌容易死亡、毒力易減弱等不足，也有利于提高檢驗的可重復性，保證檢驗結(jié)果的一致性、穩(wěn)定性和檢驗成功率，降低了檢驗工作量，提高了效率，為豬丹毒疫苗效力檢驗攻毒用培養(yǎng)物標準品的制備提供了試驗基礎(chǔ)。

下一步，可以將本研究制備的豬丹毒絲菌凍干培養(yǎng)物制成效力檢驗攻毒標準品在三個層次上應用于豬丹毒疫苗的效力檢驗。一是在一次檢驗中，對該凍干培養(yǎng)物進行預活菌計數(shù)，根據(jù)預計數(shù)結(jié)果梯度稀釋后，注射實驗動物小鼠或本動物豬進行測毒，然后對待檢疫苗免疫組和對照組動物攻毒來評價疫苗的免疫效力；二是該凍干培養(yǎng)物所含活菌數(shù)在監(jiān)測使用期內(nèi)穩(wěn)定(在活菌計數(shù)方法偏差范圍內(nèi))，在一次檢驗中，按照監(jiān)測標定的活菌數(shù)，測毒后即可攻毒；三是該凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)和毒力在使用期內(nèi)均穩(wěn)定，在一次使用標準實驗動物小鼠檢驗中，不進行活菌計數(shù)和測毒，根據(jù)標定的活菌數(shù)和毒力，按照固定比例稀釋后，直接對待檢疫苗組和對照組實驗動物進行攻毒。