孫茂永

(武陟縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南武陟 454950)

20世紀(jì)微生物學(xué)對人類最為重大的貢獻之一是抗生素的產(chǎn)生，它一產(chǎn)生就在臨床上具有了統(tǒng)治地位，在治療細(xì)菌感染所表現(xiàn)出來的優(yōu)勢使其越來越難以被其他藥物所取代。因其優(yōu)異的療效，在臨床上開始大肆不合理的使用抗生素，并且形成了依賴，大量細(xì)菌已經(jīng)開始產(chǎn)生耐藥性，且常以多重耐藥為特點[1-3]。耐藥菌株大量出現(xiàn)后，原本在臨床上用抗生素治療的疾病開始出現(xiàn)感染和復(fù)發(fā)，并且往往導(dǎo)致治療失敗，甚至使患病群體死亡，最令人們恐懼的是“超級細(xì)菌”的產(chǎn)生?，F(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展迅速，畜牧業(yè)中廣泛使用和濫用抗生素，大量產(chǎn)生抗藥性細(xì)菌，增加了治療難度，同時也增加了死亡率。中草藥在治療病原菌引起的疾病方面所表現(xiàn)出來的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛引起了全世界的關(guān)注。世界各國的科學(xué)家也對中草藥進行了越來越廣泛和深入的研究。中藥在中國已經(jīng)使用了數(shù)千年，它的毒性副作用很小，成本低，安全性高，無抗生素耐藥性，本研究對臨床上多種中草藥進行篩選和觀察，選出了在臨床抗菌方面具有成效的5種中藥，觀察其對豬源大腸桿菌的最小抑菌濃度，同時測定其逆轉(zhuǎn)耐藥性，以期為以后治療微生物感染類疾病的理論指導(dǎo)提供幫助以及有效成分的分離及中獸藥臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品 金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草共5種中藥均采購于洛陽同仁堂大藥房?？股厮幟艏埰?、青霉素、紅霉素、慶大霉素、強力霉素和舒巴坦5種抗菌藥物均購于上海廣銳生物科技有限公司。

1.1.2 菌種 豬源大腸桿菌(k88、k99)都由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)臨床實驗室鑒定保存。

1.1.3 試劑 蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂粉、燃燒用酒精、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水、醫(yī)用消毒酒精。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作臺、高壓鍋、天平、電爐、平皿、移液器。

1.2 實驗方法

1.2.1 中草藥藥液的提取 利用傳統(tǒng)水煎法提取金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草5種中草藥藥液，每種中藥的濃度都為1 g/mL，高壓滅菌鍋內(nèi)在121～126 kpa下滅菌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 常規(guī)制備。

1.2.3 菌液的制備及稀釋 將實驗室保存的豬源大腸桿菌用接種環(huán)在超凈工作臺上酒精燈外焰半徑5 cm周圍接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，時刻注意無菌操作，而后傾斜放置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱上于37 ℃的條件下培養(yǎng)18 h，之后與標(biāo)準(zhǔn)的麥?zhǔn)媳葷峁軐φ?，用無菌生理鹽水分別稀釋菌液，稀釋至與0.5號單位的比濁管濁度相當(dāng)，將其配成大約1.5×108CFU/mL含菌量的實驗用菌液。

1.2.4 中藥抗菌活性的測定 本實驗利用平皿打孔法來觀察金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草的抗菌活性，測定的抑菌圈直徑大小作為衡量抗菌活性大小的依據(jù)，觀察記錄所有三次重復(fù)實驗的結(jié)果，計算其平均值。

1.2.5 中藥最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用梯度稀釋法測定金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草的最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 實驗數(shù)據(jù)的處理 實驗數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行生物學(xué)統(tǒng)計分析，計算其單因素方差，結(jié)果以X+SD表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

所選中藥對豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測定結(jié)果。中藥對豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測定結(jié)果見圖1和表1、表2、表3。

圖1 中藥對豬源大腸桿菌體外抗菌活性的測定結(jié)果Fig 1 Results of antibacterial activity of traditional Chinese medicines to Escherichia coli from pigs

由表1可知金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草這五種中藥的抑菌圈大小，平均抑菌圈直徑(mm)分別為23.6、20.2、22.1、15.3、17.1；由表2和表3可知金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草這五種中藥的MIC(g/mL)分別為0.2、0.3、0.2、0.6、0.5。這說明金銀花、五味子、黃連、赤芍、魚腥草對豬源大腸桿菌都有抑菌濃度，抗菌活性最好的為金銀花，五味子，且金銀花和黃連抗菌活性相同，而魚腥草和赤芍抗菌效果不明顯。

表1 5種中草藥對豬源大腸桿菌的抑菌圈直徑(mm)Tab 1 diameter of bacteriostatic ring of 5 Chinese herbal medicines against Escherichia coli from pigs (mm)

紙片自身的直徑為7 mm

表2 5味中草藥對豬源大腸桿菌最小抑菌濃度的測定Tab 2 determination of minimum inhibitory concentration of 5 Chinese herbal medicines on Escherichia coli from pigs

“++”表示中度長菌，“+”表示輕度長菌，“-”表示不長菌

表3 5種中藥對豬源大腸桿菌最小抑菌濃度的測定結(jié)果Tab 3 determination results of minimum inhibitory concentrations of five traditional Chinese medicines on Escherichia coli from pigs

3 討論與結(jié)論

3.1 中藥抗菌活性的探討 中藥種類繁多，安全可靠，副作用小，并且可抑制和殺菌，本實驗選擇的金銀花既能宣熱解毒，還能清解血毒，用于各種熱病，五味子能提高身體免疫力，滋腎等，黃連是清熱燥濕類中藥，魚腥草屬于清熱解毒藥，赤芍有清涼，活血的作用。對致病性豬源大腸桿菌的最小抑菌濃度測定結(jié)果表明，所選中藥都有抑菌效果，其中以金銀花，黃連，五味子抑菌效果明顯，魚腥草和赤芍相對較弱。

本實驗采取傳統(tǒng)的煎藥方法對所選中藥的有效成分進行提取，然后用平皿打孔法來對中藥抗菌活性進行測定，其中魚腥草對豬源大腸桿菌具有抑菌效果，且其最小抑菌濃度為500 mg/mL，但韋嬪等[4]采用改良的肉湯二倍稀釋法測定的魚腥草對豬源致病性大腸桿菌EC1,EC2,EC3,EC4,EC5最小抑菌濃度均大于500 mg/mL，及對所測的致病菌沒有抑菌效果，與本實驗測定的結(jié)果不符，與杜銀忠所報道的結(jié)果[5]也不符；他們實驗中測得的黃連對致病菌EC3,EC5最小抑菌濃度均為250 mg/mL，與本實驗測得的黃連的最小抑菌濃度200 mg/mL差別不大，但是對豬源致病性大腸桿菌EC1,EC2,EC4的最小抑菌濃度(mg/mL)為500，125，500，與本實驗差異比較大，黃連對臨床上的大腸桿菌的抑菌作用較強，這與黃玲等所報道的結(jié)果[6]一致；同時他們實驗測的金銀花對致病菌EC4的最小抑菌濃度為250 mg/mL，與本實驗測的金銀花的最小抑菌濃度200 mg/mL相差不大，但是對與EC1,EC2,EC3,EC5的最小抑菌濃度均為500 mg/mL相差很大，同時金銀花在體外對豬源大腸桿菌的抑菌效果與陳希文等的報道[7]一致，但是與劉榮欣的報告[8]不同。所以，不同藥劑對同一種致病菌的抗菌活性可能不同，這可能是有效成分不同的原因；并且同種名字的致病菌也有不同的類型，也會導(dǎo)致同種中藥出現(xiàn)不同抗菌活性的情況，這可能是同種致病菌接受中藥作用效果不同的原因；并且不同人對同一種中藥對同一種病原菌的實驗結(jié)果也不相同，這可能是不同地區(qū)中藥成分有差異，采摘季節(jié)，提取方法不同造成的。

細(xì)菌的耐藥性問題越來越受關(guān)注，并且耐藥菌株發(fā)展也越來越快，降低或消除大腸桿菌的耐藥性，使其部分或者全部恢復(fù)敏感性，對于臨床治療細(xì)菌感染及防止耐藥菌株的傳播有很大的意義，并且對人類的安全問題有很大意義。

本實驗用5種藥敏片來測定所選中藥對于豬源大腸桿菌的逆轉(zhuǎn)耐藥性問題，用SPSS軟件分析實驗結(jié)果后，所選中藥均具有逆轉(zhuǎn)致病性豬源大腸桿菌耐藥性的作用，這與韋嬪[2]等測定的黃連，金銀花，魚腥草對致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率均高于SDS對照組實驗結(jié)果吻合，同時蘆亞君等[9]測定三種方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實驗觀察中3種方劑與未經(jīng)任何逆轉(zhuǎn)的大腸桿菌都有顯著性差異，而其中三黃湯和五味消毒飲的主要成分分別有黃連和金銀花，也與本實驗的顯著性差異結(jié)果想吻合。但是根據(jù)抑菌圈直徑可以看出，同種中藥對同種致病菌的逆轉(zhuǎn)效果可能不同，這可能是時間影響其逆轉(zhuǎn)耐藥性的原因，隨著時間的改變，其逆轉(zhuǎn)耐藥性也會逐漸改變；而且，本實驗用四種藥敏片測的逆轉(zhuǎn)耐藥性效果也不盡相同，這可能說明中藥成分對不同的抗生素有不同的效果。目前來說，中藥消除細(xì)菌耐藥性的機制仍然比較復(fù)雜，但是篩選開發(fā)出抑菌效果好、耐藥性消除率高的中草藥依然是控制耐藥性發(fā)展的有效方法。

3.2 各種因素對本實驗的結(jié)果的影響 通過對本實驗與相關(guān)研究進行比較，分析得出這些差別可能與本實驗采取的中藥提取方法、提取條件、培養(yǎng)基的制備、菌種的來源、菌懸液的濃度有關(guān)，還可能與環(huán)境因素，中藥的產(chǎn)地，采摘季節(jié)等有關(guān)，并且可能和培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間甚至濕度的不同，都會對抑菌效果產(chǎn)生不同影響，這都有待進一步研究。此次實驗只是檢測各中草藥對大腸桿菌這種供試菌在體外有無抗菌作用及其逆轉(zhuǎn)性效果，而在體內(nèi)是否具有抗菌活性和逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用尚未可知，需要進一步研究。本次實驗結(jié)果為其進一步研究和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。