王慶紅，孫真崢，廖 歡，謝麗麗，陳錫龍，趙 貴

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所,貴陽 550003)

磺胺類藥物是一類應(yīng)用普遍、效果良好的抗菌藥物[1-3]，復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液在養(yǎng)殖場中被大規(guī)模使用，不僅能夠治療畜禽的疾病[4-5]，而且還能增強(qiáng)畜禽的體質(zhì)；在畜產(chǎn)品中獸藥殘留最大限量規(guī)定，磺胺最大殘留量不超過100 μg/kg[6]。如使用不當(dāng)、濫用或不遵守休藥期, 將會(huì)產(chǎn)生獸藥殘留[7-9]；同時(shí)獸藥質(zhì)量沒有好的檢測方法進(jìn)行監(jiān)管，也會(huì)給養(yǎng)殖行業(yè)帶來較大的危害[10]。

復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液主要含有磺胺嘧啶和甲氧芐啶兩個(gè)組分，在《中國獸藥典》中測定磺胺嘧啶的含量使用的是“永停滴定法”，而測定甲氧芐啶使用的是“紫外-可見分光光度法”[11-12]，但檢測繁瑣，有機(jī)試劑較多，對(duì)人的身體傷害極大。

基于以上幾點(diǎn)，建立一種既能快速定性定量檢測，又對(duì)人身體傷害較小的方法很有必要。利用高效液相色譜儀對(duì)復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液進(jìn)行檢測，一次性能夠測定兩個(gè)組分，并且定量準(zhǔn)確，操作簡便。目前高效液相色譜儀測定復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液幾乎沒有研究，因此建立高效液相色譜法測定復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液不僅對(duì)獸藥監(jiān)管很有必要，而且對(duì)畜禽產(chǎn)品質(zhì)量起到重要保障[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 Denver instrument TB-215 D型電子分析天平(美國丹佛公司)；Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；

1.1.2 對(duì)照品 ①磺胺嘧啶對(duì)照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0361504，含量99.5%；甲氧芐啶對(duì)照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0161210，含量100.0%。

②原料藥：磺胺嘧啶鈉：洛陽市正牧生物科技有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥原字162441631；批號(hào)：20180301；生產(chǎn)日期：20180308；含量：99.8%。甲氧芐啶：壽康富康制藥有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H37020335；批號(hào)：A-10111710094；生產(chǎn)日期：20171031；含量：99.3%。

1.1.3 試驗(yàn)樣品 收集了3批不同公司生產(chǎn)的復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液制劑樣品，樣品信息見下表：

表1 試驗(yàn)樣品信息Tab 1 Test sample information

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取磺胺嘧啶對(duì)照品約50 mg及甲氧芐啶約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得磺胺嘧啶濃度約為1.00 mg/mL及甲氧芐啶濃度約為0.2 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液5 mL置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得磺胺嘧啶濃度約為100 μg/mL及甲氧芐啶濃度約為20 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制 精密量取復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液5 mL(10 mL:1.0 g磺胺嘧啶鈉+0.2 g甲氧芐啶)，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。另取上述稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。再另取第二次稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 色譜方法 色譜柱:為Waters Symmetry C18(5 μm, 4.6 mm × 250 mm)色譜柱。柱溫40℃；進(jìn)樣量：20 μL；測定波長240 nm；流動(dòng)相A(0.1%磷酸溶液)與B(乙腈)85∶15等度洗脫。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，其中，磺胺嘧啶結(jié)果乘以1.0878，即為供試品中磺胺嘧啶鈉(C10H9N4NaO2S)的含量。在此色譜條件下，磺胺嘧啶和甲氧芐啶兩主峰附近均沒有明顯的干擾峰，并且對(duì)照品溶液和樣品溶液主峰分離度好、保留時(shí)間一致，說明該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性及范圍 精密量取對(duì)照品貯備液20 mL置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得含磺胺嘧啶200 μg/mL、含甲氧芐啶40 μg/mL的樣品，依次吸取10 mL到20 mL分別得磺胺嘧啶12.5、

圖1 復(fù)方磺胺嘧啶鈉濃度為100 μg/mL對(duì)照品和樣品圖譜Fig 1 Chromatograms of reference substance of compound sulfadiazine sodium(100 μg/mL)

25、50、100、200 μg/mL及甲氧芐啶2.5、5、10、20、40 μg/mL的對(duì)照品溶液系列，精密吸取各對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以磺胺嘧啶或甲氧芐啶色譜峰面積(Area)，對(duì)其相應(yīng)濃度(Amt，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程，可知磺胺嘧啶鈉在12.5～200 μg/mL及甲氧芐啶分別為2.5～40 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。相關(guān)數(shù)據(jù)分別見表2和表3。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度 按照《中國獸藥典》中藥物回收率添加方法，在已知含量的復(fù)方磺胺嘧啶鈉供試品中加入一定質(zhì)量的磺胺嘧啶和甲氧芐啶原料，使其制備后在供試品中的量為其含量的80%，100%和120%，每個(gè)添加水平平行制備3份，其中磺胺嘧啶鈉添加量為200、250、300 mg，甲氧芐啶添加量40、50、60 mg，按照2.2.3的方法測定峰面積，計(jì)算實(shí)際測得的量(實(shí)測值)，用實(shí)際測得的量比上樣品的量與加入量的和，即得。回收率在98%～101%，準(zhǔn)確度符合《中國獸藥典》回收率范圍要求；以變異系數(shù)來衡量精密度，RSD均小于2%，精密度符合《中國獸藥典》關(guān)于精密度的要求。

表2 磺胺嘧啶鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)[14]Tab 2 Standard curve data of sulfadiazine sodium solution

表3 甲氧芐啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab 3 Standard curve data of trimethoprim

表5 磺胺嘧啶鈉回收率測定結(jié)果Tab5 Recovery results of sulfadiazine sodium

表6 甲氧芐啶回收率測量結(jié)果Tab 6 Recovery results of trimethoprim

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取含磺胺嘧啶鈉濃度約為100 μg/mL及甲氧芐啶約為20 μg/mL的樣品溶液20 μL，分別約于0、24、48 h上機(jī)測定，每次進(jìn)樣2針，結(jié)果見表7?；前粪奏もc和甲氧芐啶色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.7% 和1.9%，表明此法配置的溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 7 Stability measurement results

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相比例的選擇[14-15]比較了3種比例的流動(dòng)相，即0.1%磷酸-乙腈(80∶20)、(85∶15)和(90∶10)，其中0.1%磷酸-乙腈(80∶20)的流動(dòng)相運(yùn)行樣品時(shí)，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰沒有完全分離，0.1%磷酸-乙腈(90∶10)的流動(dòng)相運(yùn)行樣品時(shí)，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰分離較好，但甲氧芐啶色譜峰出峰時(shí)間較長30 min。而0.1%磷酸-乙腈(85∶15)時(shí)，磺胺嘧啶色譜峰和甲氧芐啶色譜峰分離良好,磺胺嘧啶你和甲氧芐啶的出峰時(shí)間分別為6.7 min和8.5 min，故選擇流動(dòng)相0.1%磷酸-乙腈的比例為85∶15。

3.2 樣品處理溶劑的選擇[16-17]由于磺胺嘧啶，甲氧芐啶在水中都幾乎不溶，在酸中易溶，即分別選擇兩種溶劑比較。溶解分別選用兩種溶劑系統(tǒng)的比較。溶劑一：先加5 mL鹽酸再加流動(dòng)相定容；溶劑二：前兩步稀釋選用甲醇定容。結(jié)果分析：選用溶劑一在操作步驟上要注意細(xì)節(jié)，比如加鹽酸到樣品中搖勻后需要立即定容，步驟較繁瑣，選用溶劑二在操作上更簡便。前兩步均用甲醇稀釋的樣品溶解更完全。

利用已建立好的“高效液相色譜法測定復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液”對(duì)50批復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液進(jìn)行含量測定，方法不僅操作簡便，定量準(zhǔn)確，而且能夠一次完成兩個(gè)組分的測定，不需要分兩次測定藥物含量，添加回收率范圍在98%～101%，符合《中國獸藥典》的高效液相色譜法添加回收的要求，可以作為《中國獸藥典》復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液方法的有效補(bǔ)充，對(duì)該類獸藥質(zhì)量監(jiān)管提供了一種更為有效的檢測手段，為畜產(chǎn)品質(zhì)量起到保駕護(hù)航的作用。