萬強(qiáng)，王孝威，原翔，劉怡文，姚童翔，周福有#

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003

2安陽腫瘤醫(yī)院胸外科，河南 安陽 455000

3河南省腫瘤分子與表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003

微小RNA（microRNA，miRNA）在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9-5p作為miRNA中的一員，在乳腺癌、骨肉瘤和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2-4]。有報(bào)道指出，miRNA-9在食管癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和食管癌發(fā)展有關(guān)[5]。NOTCH信號(hào)通路是食管癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的調(diào)控通路，notch受體2（notch receptor 2，NOTCH2）是該通路的主要成員，其在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控食管癌的增殖、遷移和侵襲等過程[6-7]。目前，關(guān)于miRNA-9-5p在食管癌中的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NOTCH2可能是miRNA-9-5p的潛在靶點(diǎn)。本研究通過分析miRNA-9-5p和NOTCH2在食管癌中的表達(dá)情況，探討miRNA-9-5p通過靶向NOTCH2對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期為食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的線索，為其診斷和治療提供新的標(biāo)志物和靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集和細(xì)胞 收集2016年10月至2018年3月于安陽腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的食管癌患者50例，取食管癌組織及距病變組織5 cm的癌旁正常組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療和生物治療，均經(jīng)病理檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，標(biāo)本離體后立即放入液氮中并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。術(shù)前收集患者血清，并以健康體檢者的血清作為對(duì)照，將血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC以及食管癌細(xì)胞株TE-1、ECA109和KYSE410均購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 pcDNA3.0-NOTCH2質(zhì)粒和pcDNA3.0質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)。RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青鏈霉素購自華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，二甲基亞砜、RIPA細(xì)胞裂解液和4×蛋白上樣緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司，miRNA-9-5p mimics、miRNA-9-5p inhibitor及其相應(yīng)的陰性對(duì)照均購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司。Trizol試劑、Lipofectamine 2000試劑均購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、NOTCH2抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國 Milipore公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，酶標(biāo)儀購自奧地利Anthos公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含100 U/ml青霉素、100 μg鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HEEC、TE-1、ECA109和KYSE410細(xì)胞，置于無菌的含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，以胰蛋白酶消化傳代。收集生長良好的第4代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá) 向待測(cè)組織、細(xì)胞或血清中加入Trizol裂解液，提取總RNA。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度后，參照試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋引物（由廣州復(fù)能基因生物公司合成）使其濃度為10.0 μmol/L。取上下游引物各 0.8 μl，cDNA 模板 2.0 μl、Master Mix 10.0 μl和 ddH2O 6.4 μl配成20 μl的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。其中，miRNA-9-5p的正向引物為5'-GTG-CAGGGTCCGAGGT-3'，反向引物為5'-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3'；U6的正向引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物為 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；NOTCH2的正向引物為5'-TACCTGCCGATGTGCTCC-3'，反向引物為5'-CGAGAGTGAAGTCGCCAGTC-3'；GAPDH的正向引物為5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物為5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長期的KYSE410細(xì)胞以每孔105個(gè)平鋪于6孔細(xì)胞板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待融合度達(dá)80%時(shí)，參照Lipofectamine 2000試劑說明書步驟進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為Control組（未轉(zhuǎn)染）、NC組（轉(zhuǎn)染miRNA-control）和miRNA-9-5p組（轉(zhuǎn)染miRNA-9-5p mimics）。轉(zhuǎn)染48 h后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。后期實(shí)驗(yàn)將KYSE410細(xì)胞隨機(jī)分為Control組（未轉(zhuǎn)染），NC組（轉(zhuǎn)染miRNA-control）、miRNA-9-5p組（轉(zhuǎn)染miRNA-9-5p mimics）、Anti-NC組（轉(zhuǎn)染Anti-miRNA-control）和Anti-miRNA-9-5p組（轉(zhuǎn)染miRNA-9-5p inhibitor），按照上述同樣方法轉(zhuǎn)染48 h后，采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)NOTCH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。后期實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染miRNA-9-5p mimics的KYSE410細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，即miRNA-9-5p+vector組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒）和miRNA-9-5p+NOTCH2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NOTCH2質(zhì)粒）。在轉(zhuǎn)染前24 h，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達(dá)80%左右時(shí)，參照上述方法分別將過表達(dá)載體pcDNA3.0-NOTCH2質(zhì)粒和空載體pcDNA3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至miRNA-9-5p+NOTCH2組和miRNA-9-5p+vector組中，待轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miRNA-9-5p的表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)NOTCH2蛋白的表達(dá)情況，噻唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，調(diào)整Control組、NC組和miRNA-9-5p組細(xì)胞的濃度為5×104/ml。以每孔100 μl接種至96孔細(xì)胞板上，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別在細(xì)胞貼壁24、48和72 h時(shí)加入濃度為 5 mg/ml的 MTT 試劑 20 μl，常溫孵育 4 h后，加入二甲基亞楓150 μl。待晶體充分溶解后，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在492 nm波長處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移侵襲實(shí)驗(yàn)：取孔徑為8 μm的Transwell小室，在上室中加入30 μl的Matrigel膠使其平鋪于小室底面，待Matrigel膠充分融合后，上室內(nèi)加入200 μl含3×103個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入600 μl含血清的培養(yǎng)液。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取出小室，除去上室中的培養(yǎng)液后，應(yīng)用棉簽小心擦去Matrigel膠和未穿過的細(xì)胞。以磷酸鹽緩沖液洗滌晾干后，加入4%多聚甲醛150 μl和結(jié)晶紫600 μl對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。作用30 min后，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值。遷移實(shí)驗(yàn)：除了無需鋪Matrigel膠外，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScanHuman軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)NOTCH2的3'UTR與miRNA-9-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。將含有miRNA-9-5p結(jié)合位點(diǎn)的NOTCH2的3'UTR片段及其突變體插入pmirGLO載體中，分別構(gòu)建野生型NOTCH2-wt和突變型NOTCH2-mut的熒光素酶報(bào)告載體。將構(gòu)建后的載體分別與miRNA-control和miRNA-9-5p共轉(zhuǎn)染至KYSE410細(xì)胞中，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，參照試劑盒步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 向待測(cè)細(xì)胞中加入100 μl RIPA細(xì)胞裂解液，充分裂解30 min后，離心收集上清液獲得細(xì)胞總蛋白。采用BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行濃度定量后，加入1/3蛋白樣品體積的4×蛋白上樣緩沖液于95℃下沸水浴5 min。將60 μg變性蛋白樣品和5 μl marker上樣至濃縮膠孔中，90 V恒壓電泳2 h。將含有目的蛋白的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。取出PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，封閉處理1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，加入一抗4℃孵育24 h，再次洗膜后，加入二抗37℃孵育1 h。經(jīng)發(fā)光劑顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-9-5p表達(dá)情況的比較

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌組織中miRNA-9-5p的表達(dá)水平為（0.48±0.08），低于癌旁正常組織的（1.00±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.55，P＜0.05）；食管癌患者血清中miRNA-9-5p的表達(dá)水平為（0.40±0.06），低于健康體檢者的（1.00±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.31，P＜0.05）。食管癌細(xì)胞株TE-1、ECA109和KYSE410中miRNA-9-5p的表達(dá)水平分別為（0.50±0.07）、（0.65±0.08）和（0.40±0.06），均低于正常食管上皮細(xì)胞株HEEC的（1.00±0.09），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.60、5.03、9.61，P＜0.05）。故后期采用KYSE410細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 miRNA-9-5p過表達(dá)對(duì)KYSE410細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞中miRNA-9-5p的表達(dá)水平為（1.00±0.08），與Control組（1.00±0.05）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miRNA-9-5p組細(xì)胞中miRNA-9-5p的表達(dá)水平為（3.80±0.35），高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.51，P＜0.05）。Control組、NC組和miRNA-9-5p組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為（86±6）、（85±5）和（40±6），侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（70±6）、（68±4）和（45±5）。miRNA-9-5p組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.98、5.41，P＜0.05）；NC組和Control組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 NOTCH2與miRNA-9-5p的靶向關(guān)系

TargetScanHuman軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NOTCH2的3'UTR與miRNA-9-5p存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與野生型NOTCH2-wt共轉(zhuǎn)染的miRNA-9-5p組細(xì)胞的熒光素酶活性為（0.49±0.07），低于與野生型NOTCH2-wt共轉(zhuǎn)染的NC組細(xì)胞的（1.00±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.91，P＜0.05）；與突變型NOTCH2-mut共轉(zhuǎn)染的NC組和miRNA-9-5p組細(xì)胞的熒光素酶活性分別為（0.99±0.07）和（1.03±0.09），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組和Anti-NC組細(xì)胞中NOTCH2蛋白表達(dá)水平分別為（1.02±0.09）和（1.02±0.13），與Control組的（1.00±0.08）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而miRNA-9-5p組細(xì)胞中NOTCH2蛋白表達(dá)水平為（0.42±0.07），明顯低于Control組的（1.00±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.12，P＜0.01）；Anti-miRNA-9-5p組細(xì)胞中NOTCH2蛋白表達(dá)水平為（1.60±0.11），明顯高于Control組的（1.00±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.12，P＜0.01）。

圖1 miRNA-9-5p與NOTCH2靶向關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果

2.4 NOTCH2在食管癌中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌組織中NOTCH2mRNA的表達(dá)水平為（3.38±0.25），高于癌旁正常組織的（1.00±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.70，P＜0.05）。食管癌細(xì)胞株ECA109、KYSE410和TE-1中NOTCH2mRNA表達(dá)水平分別為（1.85±0.15）、（3.00±0.16）、（2.50±0.12），均高于人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC的（1.00±0.08），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.66、19.36、18.01，P＜0.05）；食管癌細(xì)胞株ECA109、KYSE410和TE-1中NOTCH2蛋白表達(dá)水平分別為（1.60±0.12）、（2.72±0.14）、（2.20±0.15），均高于人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC的（1.00±0.09），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.93、17.90、11.88，P＜0.05）（圖2）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管癌組織中miRNA-9-5p與NOTCH2mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.456，P＜0.01）。

圖2 Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞株中NOTCH2蛋白表達(dá)

2.5 上調(diào)NOTCH2表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體pcDNA3.0-NOTCH2質(zhì)粒后，KYSE410細(xì)胞中miRNA-9-5p的表達(dá)水平為（1.05±0.09），與miRNA-9-5p+vector組的（1.00±0.05）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NOTCH2質(zhì)粒的miRNA-9-5p+NOTCH2組細(xì)胞中NOTCH2蛋白的表達(dá)水平為（2.00±0.06），高于miRNA-9-5p+vector組的（1.00±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.18，P＜0.05）（圖3）。成功上調(diào)NOTCH2的表達(dá)后，miRNA-9-5p+NOTCH2組和miRNA-9-5p+vector組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（65±4）和（35±5），遷移細(xì)胞數(shù)分別（75±5）和（40±6），兩組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.12、7.76，P＜0.05）。

圖3 Western blot 檢測(cè)不同組別食管癌細(xì)胞中NOTCH2蛋白表達(dá)

3 討論

在生物體內(nèi)存在著大量的miRNA，其可通過降解或抑制靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-10]。miRNA-9是miRNA中的重要成員，在多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，調(diào)控著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在急性髓系白血病中，miRNA-9-5p的高表達(dá)是患者預(yù)后不良的重要因素[11]。miRNA-9-5p在舌癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，其可通過靶向抑制Ambra1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[12]。在胃癌中，miRNA-9-3p是一種新的抑癌基因，其在胃癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，與患者總體生存率低有關(guān)，miRNA-9-3p過表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲[13]。骨肉瘤中，miRNA-9-5p過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[3,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9-5p在食管癌組織、食管癌患者血清和食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均降低，從TE-1、ECA109和KYSE410三種食管癌細(xì)胞株中篩選出miRNA-9-5p低表達(dá)最為顯著的KYSE410細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過轉(zhuǎn)染miRNA-9-5p mimics成功上調(diào)miRNA-9-5p的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)KYSE410細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯減弱，這一結(jié)果與張?chǎng)15]的研究得出的miRNA-9過表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞增殖和遷移的結(jié)論相符合。說明miRNA-9-5p在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因的作用。

通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-9-5p與NOTCH2的3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，NOTCH2可能是其潛在的靶點(diǎn)。通過雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，NOTCH2是miRNA-9-5p的靶基因；RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)miRNA-9-5p可負(fù)向調(diào)控NOTCH2的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)NOTCH2在食管癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，NOTCH2在食管癌組織中高表達(dá)；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，其表達(dá)與miRNA-9-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NOTCH2在TE-1、ECA109和KYSE410細(xì)胞中高表達(dá)，其中KYSE410細(xì)胞中NOTCH2高表達(dá)最顯著，通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NOTCH2過表達(dá)載體質(zhì)粒上調(diào)NOTCH2的表達(dá)，對(duì)KYSE410細(xì)胞中miRNA-9-5p的表達(dá)無影響，但能夠明顯促進(jìn)miRNA-9-5p高表達(dá)的KYSE410細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。食管癌的發(fā)生發(fā)展離不開眾多信號(hào)通路的調(diào)控，NOTCH信號(hào)通路就是其中一個(gè)重要通路[16-17]，包括NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4四個(gè)NOTCH同源體，其中NOTCH2在食管癌中異常高表達(dá)，干預(yù)其表達(dá)能夠減緩腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[7,18-19]。上述結(jié)果提示，miRNA-9-5p可通過直接靶向NOTCH2抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而調(diào)控食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miRNA-9-5p在食管癌中低表達(dá)，其靶基因NOTCH2高表達(dá)，兩者在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，miRNA-9-5p過表達(dá)可通過靶向調(diào)控NOTCH2抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而NOTCH2如何調(diào)控下游效應(yīng)分子還有待后期進(jìn)一步深入研究。這一結(jié)果為miRNA-9-5p和NOTCH2在食管癌中的作用提供了新的認(rèn)識(shí)，并為miRNA-9-5p和NOTCH2作為食管癌診斷和治療的標(biāo)志物及靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。