華麗，陳紹俊#，陳海輝，黃海欣，蒙以良，林展

1柳州市工人醫(yī)院腫瘤科，廣西 柳州 545005

2百色市人民醫(yī)院放療科，廣西 百色 533000

3玉林市第一人民醫(yī)院放療科，廣西 玉林 537000

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因。早期診斷鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移能把握最佳挽救性治療的時(shí)機(jī)。但傳統(tǒng)基于鼻咽鏡、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）等檢查的隨訪監(jiān)測機(jī)制，并不能對鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移做出及時(shí)的響應(yīng)。血漿EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）-DNA定量檢測已在常規(guī)治療中被證實(shí)與鼻咽癌預(yù)后有關(guān)，是目前反映鼻咽癌診治及預(yù)后和監(jiān)測價(jià)值相對肯定的生物學(xué)因素，而調(diào)強(qiáng)放療（intensity modulated radiation therapy，IMRI）模式下EBV-DNA載量是否還與鼻咽癌的預(yù)后有關(guān)則需要重新評價(jià)。本研究通過分析接受IMRI的Ⅱ期鼻咽癌患者治療及隨訪過程中血漿EBV-DNA定量水平動態(tài)變化，探討其在Ⅱ期鼻咽癌患者診斷、療效評價(jià)和隨訪監(jiān)測中的臨床意義，擬為Ⅱ期鼻咽癌的生物分層提供一定依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2012年10月廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院及區(qū)內(nèi)多家三甲醫(yī)院收治的108例經(jīng)鼻咽部活檢確診為Ⅱ期[1]鼻咽部低分化鱗狀細(xì)胞癌的患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)期生存期＞6個(gè)月；②體力評分為0～2分；③中性粒細(xì)胞≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，血肌酐＜12 mg/L，總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶≤2.5倍正常參考值上限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無病理診斷；②復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；③合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病。108例Ⅱ期鼻咽癌患者中，男62例，女46例；年齡15～73歲，中位年齡46歲。另外選取108例同時(shí)期在門診體檢的健康志愿者作為對照組。對照組與病例組患者按1∶1匹配，匹配條件：與病例組患者同種族、同性別，年齡與病例組患者發(fā)病年齡（以診斷時(shí)年齡為準(zhǔn)）±3歲，無血緣關(guān)系，出生居住地域接近，血常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯異常等。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方法

病例組患者均接受IMRI聯(lián)合或不聯(lián)合同期化療。順鉑同期放化療的方案：順鉑80 mg/m2靜脈滴注，于放療第1、22、43天進(jìn)行。IMRI采用6 MV直線加速器，5次/周，具體劑量：鼻咽癌計(jì)劃靶體積（plan gross target volume nasopharynx，PGTVnx）70.06 Gy/31次，淋巴結(jié)計(jì)劃靶體積（plan gross target volume node，PGTVnd）70.06 Gy/31次，計(jì)劃靶體積1（plan target volume1，PTV1）66.03 Gy/31次，計(jì)劃靶體積2（plan target volume 2，PTV2）54.25 Gy/31次。

1.3 標(biāo)本采集

所有研究對象均接受血漿EBV-DNA定量檢測。病例組患者每次采血3 ml，加入EDTA抗凝管中，2000 r/min離心 5 min，取 200 μl血漿于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩BV-DNA的提取及擴(kuò)增步驟：將凍存血漿置于室溫環(huán)境，嚴(yán)格按照EBV熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取；將混合的PCR反應(yīng)液在ABI 7300 PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測，PCR反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，30個(gè)循環(huán)。在治療的第1、2、4、6周及治療結(jié)束后1周對血漿EBVDNA進(jìn)行定量檢測，評價(jià)近期療效，并對治療結(jié)束后1周血漿EBV-DNA陽性且獲隨訪的患者在第3、5年繼續(xù)進(jìn)行EBV-DNA定量檢測，評估治療后3、5年的局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況。對照組只采集1次外周血，采血方法與病例組相同。血漿EBV-DNA濃度計(jì)算公式：C=Q×（VDN/VPC）×（1/VEXT）。血漿DNA＞1×102拷貝/毫升判定為陽性。

1.4 隨訪

隨訪截至2017年10月，有5例失訪，隨訪率為95.37%（103/108）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)、中位數(shù)（M）及率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析診斷價(jià)值；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿EBV-DNA陽性檢出率的比較

治療前108例患者共檢出100例血漿EBVDNA陽性（92.59%），104例（96.30%）患者血漿中可檢出EBV-DNA，EBV-DNA的中位濃度為3.15×105拷貝/毫升。對照組EBV-DNA陽性檢出11例（10.19%）。治療前病例組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=146.798，P=0.000）。動態(tài)監(jiān)測EBV-DNA陽性患者的血漿EBV-DNA發(fā)現(xiàn)，42例患者在治療第1周開始EBV-DNA水平明顯下降，89例患者在治療第2周開始逐漸下降，至治療的6～7周大部分患者基本檢測不到EBV-DNA，治療結(jié)束后1周，94例患者檢測不到EBV-DNA，明顯低于治療前。8例患者在治療的第1～4周EBV-DNA無變化，但在治療結(jié)束前2周，也基本檢測不到。治療后病例組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率（12.96%）明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=137.387，P=0.000）。

2.2 血漿EBV-DNA定量與近期療效的關(guān)系

100例治療前血漿EBV-DNA陽性的病例組患者治療結(jié)束1周后評價(jià)近期療效，完全緩解（CR）87例，部分緩解（PR）9例，疾病穩(wěn)定（SD）1例，疾病進(jìn)展（PD）3例。CR組患者EBV-DNA陽性檢出率為3.45%（3/87），PR組患者EBV-DNA陽性檢出率為88.89%（8/9）。治療結(jié)束1周EBV-DNA陽性與EBV-DNA陰性患者近期療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.748，P=0.008）。（表1、表2）

表1 EBV-DNA陽性患者治療前后血漿EBV-DNA水平與療效的關(guān)系（IU/ml，M）

表2 治療結(jié)束1周EBV-DNA陽性檢出情況與近期療效的關(guān)系[n（%）]

2.3 血漿EBV-DNA定量與遠(yuǎn)期療效的關(guān)系

100例EBV-DNA陽性患者治療結(jié)束后繼續(xù)隨訪至復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。治療結(jié)束后1周有14例患者EBVDNA檢出陽性，治療后第3年有10例患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中局部復(fù)發(fā)4例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例，血漿EBVDNA陽性患者8例，其中局部復(fù)發(fā)2例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例，血漿EBV-DNA陰性患者2例；治療后第3年EBV-DNA陽性患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于EBVDNA陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。治療結(jié)束1周血漿EBV-DNA情況預(yù)測鼻咽癌患者3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線的曲線下面積為0.922（95%CI=0.806～1.000，P=0.000），最優(yōu) cut off值為89拷貝/ml，其所對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.900、0.911（圖1）。治療后第5年有14例患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中局部復(fù)發(fā)4例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例，血漿EBV-DNA陽性患者11例，其中局部復(fù)發(fā)3例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移8例，血漿EBV-DNA陰性患者3例；治療后第5年EBV-DNA陽性患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于EBV-DNA陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。治療結(jié)束1周血漿EBV-DNA情況預(yù)測鼻咽癌患者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線的曲線下面積為 0.948（95%CI=0.864～1.000，P=0.000），最優(yōu) cut off值為80拷貝/ml，其所對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.929、0.942（圖2）。

表3 治療結(jié)束1周EBV-DNA檢出情況與遠(yuǎn)期療效的關(guān)系[n（%）]

圖1 治療結(jié)束1周血漿EBV-DNA 情況預(yù)測鼻咽癌3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

圖2 治療結(jié)束1周血漿EBV-DNA 情況預(yù)測鼻咽癌5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

鼻咽癌為EB病毒相關(guān)惡性腫瘤，發(fā)病呈明顯區(qū)域聚集傾向，好發(fā)于中國東南部各省。惡性腫瘤分期治療原則是實(shí)現(xiàn)規(guī)范化治療的前提。對于Ⅱ期鼻咽癌，盡管各指南和規(guī)范均指出同步放化療是此類患者的治療選擇，但其對優(yōu)先推薦的治療方案不盡相同，Ⅱ期鼻咽癌是否應(yīng)接受輔助化療和誘導(dǎo)化療仍存在爭議，指南推薦未能達(dá)成共識。臨床Ⅱ期鼻咽癌包括 T2N0M0、T0～1N1M0以及T2N1M0三個(gè)亞組。長期隨訪資料顯示亞組生存存在差異[2-3]。然而目前現(xiàn)有的分期系統(tǒng)不能完全體現(xiàn)Ⅱ期鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)因素分層，通過臨床分期系統(tǒng)指導(dǎo)Ⅱ期鼻咽癌治療存在一定的局限性。

EBV與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過采用PCR技術(shù)可在鼻咽癌患者血漿或血清中檢測到EBV DNA，證實(shí)外周血中EBV DNA來源于鼻咽癌腫瘤細(xì)胞。有學(xué)者應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平，顯示鼻咽癌患者血漿EBV-DNA陽性率（96%）明顯高于健康對照者（7%），同時(shí)DNA拷貝數(shù)（中位濃度：21 058拷貝/ml）和健康對照者（中位濃度：0拷貝/ml）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且晚期患者（中位濃度：47 047拷貝/ml）明顯高于早期患者（中位濃度：5918拷貝/ml）[4-5]。祝曉芬等[6]研究也表明初診、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者血漿中游離EBV DNA檢出陽性率均明顯高于健康對照者和持續(xù)緩解的鼻咽癌患者（P＜0.01）。馬德佳等[7]研究表明，早期鼻咽癌患者血漿EBV-DNA診斷靈敏度與特異度分別為95.2%和97.6%，健康成人則分別為2.9%和0，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究同樣顯示，與對照組相比，鼻咽癌患者血漿可檢測出更高水平的EBV-DNA，表明EBV-DNA可以作為鼻咽癌篩查及早期診斷有效的生物標(biāo)志物，目前分期系統(tǒng)首次將EBV用于T0期鼻咽癌的診斷，臨床對于高度懷疑鼻咽癌者，即使鼻咽沒有發(fā)現(xiàn)確切腫瘤，但通過EBV和頸部淋巴結(jié)仍然可以定義為T0期鼻咽癌。

在近期療效方面，本研究顯示CR組治療結(jié)束1周EBV-DNA陽性檢出率為3.45%，PR組則為88.89%。PD組EBV-DNA陽性患者治療期間血漿EBV-DNA水平在治療第6周仍在較高水平，治療結(jié)束1周仍可檢測出。張倩等[8]在對156例局部晚期鼻咽癌患者治療結(jié)束后的療效評價(jià)中，同樣觀察到CR組與PR組患者治療8周的血漿EBV-DNA陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而既往多個(gè)研究也表明治療結(jié)束后EBV-DNA檢出率與治療有效率相關(guān)，可以協(xié)助判斷療效，并能反映治療后殘余腫瘤負(fù)荷，成為預(yù)測鼻咽癌近期療效的一項(xiàng)客觀指標(biāo)。

在遠(yuǎn)期療效方面，本研究顯示治療結(jié)束1周EBV-DNA變化與Ⅱ期鼻咽癌患者的3年和5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率有關(guān)，治療結(jié)束1周EBV-DNA預(yù)測3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的靈敏度和特異度以及5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的靈敏度和特異度分別為0.900、0.911和0.929、0.942，同時(shí)治療結(jié)束1周血漿EBV-DNA定量水平對預(yù)測3年和5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的準(zhǔn)確度較高（ROC曲線下的面積均＞0.9）。張倩等[8]研究同樣顯示出治療8周血漿EBV-DNA定量水平對診斷鼻咽癌1、2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率具有較高的靈敏度和特異度。因此對于治療后EBV-DNA檢出陽性者，需要進(jìn)行更加密切的隨訪，包括縮短隨訪間隔時(shí)間或接受更全面的臨床和影像學(xué)檢查。Lo等[4]研究表明在腫瘤進(jìn)展前6個(gè)月即可出現(xiàn)血漿EBV-DNA升高，提示血漿EBV-DNA較常規(guī)的臨床體檢與影像學(xué)檢查對鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測具有更高的靈敏度。同時(shí)馬德佳等[7]對初治274例鼻咽癌患者隨訪5年中發(fā)現(xiàn)，治療前血漿EBV-DNA高濃度表達(dá)者總生存率和無復(fù)發(fā)生存率均低于低濃度者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。李宇紅等[9]對90例初治放療后隨診鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA定量分析表明，EBV-DNA＜40 000拷貝/ml者22個(gè)月無瘤生存率明顯高于≥40 000拷貝/ml者（P＜0.05）。提示通過對鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA定量分析，可以有效對初治鼻咽癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)等級劃分，提高對早期疾病的風(fēng)險(xiǎn)識別能力，并且能夠篩選出需要用PET-CT尋找確切復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶的部分患者[10]。因此血漿EBV-DNA定量分析與治療前后的動態(tài)監(jiān)測能夠反映和甄別出體內(nèi)腫瘤生物學(xué)行為的差異，初始治療前和治療結(jié)束后EBV-DNA水平較高的患者往往具有更高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤在生物學(xué)行為上表現(xiàn)更差。如若與分期相結(jié)合，有可能改變鼻咽癌患者亞組風(fēng)險(xiǎn)定義。目前臨床對Ⅱ期鼻咽癌的治療仍存有爭議，表現(xiàn)為對誘導(dǎo)化療和輔助化療各指南與規(guī)范意見不一致。Leung等[11]研究顯示，Ⅱ期鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA低濃度與高濃度者5年生存率分別為90%和63%，前者生存率與Ⅰ期鼻咽癌患者更相近（92%，95%CI=83～100），而后者則差于Ⅲ期鼻咽癌（73%，95%CI=64～82）。Zhang等[12]通過Meta分析14項(xiàng)前瞻性和回顧性對照研究，評估治療前、中、后血漿EBVDNA及血漿EBV-DNA半衰期與生存預(yù)后的關(guān)系，并提出一個(gè)4級系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)分層模型，認(rèn)為對于治療前血漿EBV-DNA＜40 000拷貝/ml的Ⅱ期鼻咽癌患者可能應(yīng)重新修訂分期為Ⅰ期，并只需要接受單純根治性放療；而≥40 000拷貝/ml者則可能被重新劃分為Ⅲ期，應(yīng)接受更積極的治療策略，例如新輔助化療+放化療加或不加輔助治療。如果Ⅱ期鼻咽癌患者治療中期EBV-DNA無法被檢測到，能夠被調(diào)整至Ⅰ期，如仍能被檢測到，則提示具有高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。因此未來對于Ⅱ期鼻咽癌通過納入EBV-DNA進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)等級評估指導(dǎo)下的治療才更能體現(xiàn)個(gè)體化的治療。

本研究首次基于IMRT模式下從診斷、治療及隨訪監(jiān)測對Ⅱ期鼻咽癌與EBV-DNA的關(guān)系進(jìn)行評估，顯示血漿EBV-DNA對于預(yù)測Ⅱ期鼻咽癌近遠(yuǎn)期療效均具有較高臨床意義。下一步可以考慮聯(lián)合檢測Ⅱ期鼻咽癌治療前的EBV-DNA定量水平以及更多有價(jià)值的預(yù)測因子，通過風(fēng)險(xiǎn)分層給予不同治療模式，探討對生存預(yù)后的影響。但需注意的是，不同地區(qū)鼻咽癌患者感染的EBV種類或感染率不同，而且可能與檢測方法也相關(guān)。此外腫瘤消退后患者EBV-DNA水平是否穩(wěn)定，預(yù)測的靈敏度及特異度效能如何，均有待進(jìn)一步研究及擴(kuò)大樣本量以明確。