胡朝勇,郭永清

(1山西醫(yī)科大學麻醉學院山西省人民醫(yī)院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:gyq106968@aliyun. com)

急性腦梗死是臨床常見的腦血管疾病,致殘率及致死率均較高,雖然近年來溶栓治療手段不斷進步,但缺血腦組織在溶栓過程中發(fā)生血流再灌注可加重組織損傷,即缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷[1,2]。腦I/R損傷的可能機制包括炎癥反應、氧化應激、自噬、凋亡等,其中自噬是受到越來越多關注的機制之一[3,4]。已有研究表明,腦I/R過程中細胞自噬加劇,這可能是腦組織在缺血缺氧及I/R條件下自我保護的代償機制之一[5];多種具有神經保護功能的藥物能夠在腦I/R損傷過程中激活自噬,這可能是不同藥物發(fā)揮神經保護功能的分子機制[6-8]。因此,調節(jié)自噬也被認為是減輕腦I/R損傷的重要靶點。

右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是臨床廣泛使用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物,多用于全麻輔助和ICU鎮(zhèn)靜,通過高選擇性激活α2腎上腺素能受體發(fā)揮作用。Dex預處理能夠減輕腦I/R損傷及I/R局部的炎癥反應,但Dex在腦I/R損傷過程中對細胞自噬的調控作用尚不明確。因此,本實驗將以腦I/R損傷大鼠為對象,探討Dex對大鼠腦I/R損傷及自噬的影響,旨在進一步明確Dex在腦I/R損傷過程中的保護作用及相應的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購自山西醫(yī)科大學動物中心,8-10周齡、150-180 g,生產許可證:許可證號 SCXK(晉)2019-0004;飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h的光/暗周期、濕度55%-65%、溫度20-24 ℃,自由攝食飲水。

1.2 主要試劑及儀器

右美托咪定(江蘇恒瑞公司)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司,Beclin-1, LC3、p-AMPK的抗體購自英國Abcam公司。正置顯微鏡購自日本尼康公司,透射電鏡購自日本日立公司,凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔公司。

1.3 動物分組、造模及給藥

SD大鼠隨機分為對照組、I/R組和Dex組,每組12只。對照組進行假手術操作,分離一側頸動脈,不做其他干預;I/R組在造模前30 min腹腔注射0.25 ml生理鹽水;Dex組在造模前30 min,腹腔注射0.5 ml/kg右美托咪定生理鹽水稀釋至0.25 ml。I/R組和Dex組采用線栓法建立腦I/R模型,腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉,做頸正中切口后分離一側頸總動脈,切開并向頭端置入一預先用酒精燈燒成圓頭的肝素浸泡過的尼龍絲線栓,感到有阻力后停止,保留線栓90 min,而后取出,完成造模、縫合切口。

1.4 神經功能評分

再灌注24 h時,按照Longa等[9]研究中的神經功能評分進行評價,具體標準見表1。

表1 神經功能評分標準

Table 1 Standard of neurological function score

評分 標準0分無神經功能缺損癥狀1分缺血對側前爪屈曲2分行走時向對側旋轉3分行走時向對側傾倒4分意識喪失

1.5 腦梗死面積的TTC染色檢測

再灌注24 h時,每組隨機選擇6只大鼠,麻醉狀態(tài)下斷頭處死后取腦組織,-20 ℃冰凍20 min,而后沿冠狀面切成每片厚度2 mm的腦片,共5片,在2%TTC溶液中避光孵育30 min,而后在10%多聚甲醛溶液中固定,數碼相機拍照記錄,用ImageJ軟件計算5張切片中的梗死面積,按照公式(A1+A2+A3+A4+A5)/(S1+S2+S3+S4+S5)×100%計算腦梗死面積,A1-A5為每一片的腦梗死面積，S1-S5為每一片的腦組織總面積。

1.6 自噬小體檢測

再灌注24 h時,每組隨機選擇6只大鼠,斷頭法處死后取缺血腦組織、約1 mm3,在2.5%戊二醛溶液中固定并保存,檢測時用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗組織塊3次,放入1%鋨酸中、4 ℃固定1 h,70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水后環(huán)氧樹脂包埋,-80 ℃聚合24 h,制作60-70 nm厚度的切片并用3%檸檬酸鉛染色,最后在透射電鏡下觀察,隨機選擇10個細胞并對細胞內的自噬小體進行計數。

1.7 Western blot檢測Beclin-1、LC3、p-AMPK表達

取1.6中6只大鼠剩余的缺血腦組織,加入RIPA裂解液并勻漿,勻漿液12 000 r/min,離心10 min,分離上清后測定蛋白含量,取30 μg蛋白樣本進行Western blot檢測,在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,而后電轉移至NC膜,NC膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,放入1 ∶1 000稀釋的Beclin-1、LC3、p-AMPK、AMPK抗體中4 ℃孵育過夜;加1 ∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗,室溫孵育1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶,根據蛋白條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0軟件錄入數據,計量資料以均數±標準差表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Dex對I/R大鼠神經功能評分的影響

與對照組比較,I/R組的神經功能評分明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠的神經功能評分明顯降低(P<0.05,見圖1)。

2.2 Dex對I/R大鼠腦梗死面積的影響

與對照組比較,I/R組的腦梗死面積明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠的腦梗死面積明顯縮小(P<0.05,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖1 三組大鼠神經功能評分的比較Figure 1 Comparison of neurological function among three groups

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖2 三組大鼠腦梗死體面積的比較Figure 2 Comparison of cerebral infarction volume among three groups

2.3 Dex對I/R大鼠缺血腦組織中自噬小體形成的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中自噬小體形成增多;與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中自噬小體形成進一步增多(見圖3)。

黃色箭頭所指為自噬小體;與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖3 三組大鼠缺血腦組織中的自噬小體Figure 3 Autophagy bodies in ischemic brain tissues after different treatment

2.4 Dex對I/R大鼠缺血腦組織中自噬標志基因表達的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達明顯上調(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達顯著上調(P<0.05,見圖4)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖4 三組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達量的比較Figure 4 Comparison of Beclin-1, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression in ischemic brain tissues among three groups

2.5 Dex對大鼠缺血腦組織中自噬信號通路激活的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中p-AMPK的表達水平明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中p-AMPK的表達水平明顯增加(P<0.05，見圖5)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖5 三組大鼠缺血腦組織中p-AMPK表達量的比較Figure 5 Comparison of p-AMPK expression in ischemic brain tissues among three groups

3 討論

器官組織缺血后恢復血液灌注,缺血性損傷進一步加重的現象,稱為缺血-再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷時對腦組織造成損傷的主要因素,不是缺血本身,而是恢復血液供應后過量的自由基生成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等[3,4]。臨床上頸動脈內膜剝脫術、心臟體外循環(huán)、器官移植、心肺復蘇、神經外科介入手術、感染等都可能發(fā)生腦缺血后再灌注損傷。由于大腦對缺氧和缺血極其敏感,圍手術期腦缺血再灌注損傷可能成為術后恢復延遲、術后譫妄和術后認知功能障礙和死亡的重要危險因素之一,因此圍術期腦保護是保障患者術后良好康復的重要措施。

研究顯示,右美托咪定(Dex)通過激活 PI3K/Akt 途徑,抑制細胞凋亡,阻止casepase-3 級聯(lián)反應而發(fā)揮神經保護作用。陳萌等[6]、Zhang等[7]、Ahsan等[8]在腦I/R損傷中使用具有神經保護作用的藥物干預并觀察到細胞自噬被激活,提示激活自噬是神經保護藥物減輕腦I/R損傷的機制。Dex減少缺血缺氧性損傷,發(fā)揮腦保護作用,Chi等[10]通過動物實驗證實,出血時使用右美托咪定可減少局部的腦血流量(CBF)和腦代謝率(CMR),保持腦氧供需平衡狀態(tài),發(fā)揮神經保護作用。顱腦外傷患者圍手術期給予右美托咪定鎮(zhèn)靜有利于腦組織的氧供需平衡或促進受損組織的血液灌注[11]。研究顯示，Dex對腦缺血再灌注損傷大鼠認知功能及神經功能具有保護作用[12]。全麻手術老年患者應用右美托咪定可減輕術后認知功能障礙,機制可能與降低線粒體膜電位,減少線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性損傷有關[13]。右美托咪定抑制N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過度激活,減少興奮性氨基酸的釋放,降低興奮性氨基酸毒性[14],Dex可抑制 NF-κB 的激活,降低 TNF-α、IL-6 水平,減輕脂多糖誘導的大鼠海馬區(qū)神經損傷[15];Dex預處理可抑制線粒體凋亡通路,抑制細胞內鈣超載,減輕神經元的氧化應激損傷[16],調節(jié)凋亡和自噬。本實驗結果顯示,I/R大鼠的神經功能評分明顯增加,腦組織TTC染色后顯示明顯的腦梗死病灶,Dex預處理后大鼠的神經功能評分降低、腦梗死體積均較I/R大鼠明顯減少,提示Dex對大鼠腦I/R損傷具有保護作用。

自噬是近年來發(fā)現在腦I/R損傷過程中起保護作用的生物學環(huán)節(jié),細胞內各種基質及細胞器通過溶酶體系統(tǒng)降解,是保證細胞在各種壓力環(huán)境下存活的重要生物學環(huán)節(jié)。腦I/R損傷過程中,自噬的激活是機體自我保護的代償機制,能夠平衡細胞合成和分解代謝,為缺血缺氧的細胞供能并在一定程度上減輕I/R損傷。在缺血缺氧等應激狀態(tài)下自噬作為機體的一種防御機制,通過適時清除損傷及老化的細胞器,維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定以及細胞的正常生長。缺血再灌注損傷時,線粒體產生的活性氧爆發(fā)以及線粒體通透性的改變均可誘發(fā)自噬,而自噬對于維持細胞線粒體的功能也扮演著重要的角色。有研究在脊髓、肺、腸缺血再灌注動物模型中觀察到Dex能激活自噬減輕組織缺血再灌注損傷[17-19]。

AMPK通路是目前已知調控細胞自噬的關鍵信號通路,信號分子AMPK能夠感受細胞外能量變化并調控能量代謝;AMPK磷酸化激活不僅對缺血缺氧、I/R等損傷具有保護作用,也能在缺血缺氧、I/R過程中激活自噬[20-22]。本實驗結果顯示,右美托咪定預處理后大鼠缺血腦組織中自噬小體形成增加、自噬標志基因Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達上調、自噬信號通路p-AMPK激活,提示Dex預處理能激活大鼠腦I/R損傷過程中的自噬和AMPK通路。自噬的激活可能是腦組織自我保護的代償機制,也可能是Dex減輕腦I/R損傷、腦保護作用的機制之一。

綜上所述,Dex預處理能減輕大鼠腦I/R損傷并促進自噬,激活AMPK通路是可能的分子機制,但AMPK在Dex減輕腦I/R損傷并促進自噬中的直接作用仍有待進一步研究證實。