孔德亮,徐愛靜,李 娟,賴學(xué)莉,郭志勇*

(1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,上海 200433;2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:snxingwen@126.com)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是腎臟替代的一種形式,而腹膜作為溶質(zhì)和水交換的可滲透屏障,其持續(xù)暴露于透析液可引起腹膜的急慢性炎癥和損傷,出現(xiàn)進(jìn)行性纖維化,血管生成和血管病變,導(dǎo)致腹膜透析終止與永久性腹膜膜損傷[1,2]。人腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)作為腹膜結(jié)構(gòu)的主要組成部分,其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在誘導(dǎo)纖維化和腹膜功能惡化等病理過程中起了主要作用[3,4]。因此,分析HPMC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腹膜透析充分性中起了關(guān)鍵的作用[5]。

TGF-β1是誘導(dǎo)間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化的主要調(diào)節(jié)劑[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7],在葡萄糖、酸性pH和感染的刺激下,TGF-β1的產(chǎn)生增多,從而促進(jìn)器官纖維化過程中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和膠原產(chǎn)生,主要表現(xiàn)為TGF-β1的過度表達(dá)與腹膜透析預(yù)后的惡化相關(guān)。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoid domain receptor 1,DDR1)是一種新型的受體酪氨酸蛋白激酶,能夠通過與膠原蛋白結(jié)合,激活DDR1的活性,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等[8]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)DDR1的表達(dá)是預(yù)測胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的一個生物標(biāo)志物,DDR1的抑制在腹膜移植的小鼠模型中能誘導(dǎo)顯著的抗腫瘤作用[9]。而研究證實(shí),在腎小管上皮細(xì)胞沉默DDR1可以延緩細(xì)胞炎癥反應(yīng)和間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10],且DDR1能激活間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。以上研究提示,DDR1與腹膜存在一定相關(guān)性且可誘導(dǎo)組織間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。但是有關(guān)DDR1與腹膜間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系尚不清楚,因此,本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究DDR1在TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCs間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)細(xì)胞 人腹膜間皮細(xì)胞株購自于美國ATCC公司(貨號:HBT-113)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 TGF-β1(Proteintech公司);胎牛血清(Gibco公司);DDR1兔IgG一抗抗體、E-cadherin鼠一抗抗體和α-SMA兔一抗抗體(美國CST公司);β-actin鼠一抗抗體(江蘇碧云天公司);Western blot一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天公司);HRP標(biāo)記兔二抗、HRP標(biāo)記鼠二抗(武漢博士德生物公司);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Hoyclone公司);BCA蛋白濃度定量試劑盒(江蘇碧云天公司);蛋白marker(江蘇碧云天公司);DAPI染料(江蘇碧云天公司);CCK-8溶液(江蘇碧云天公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州銳博公司);DDR1引物(廣州銳博公司)。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司);-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán));4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司);超凈工作臺(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司);脫色搖床(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司);多功能酶標(biāo)儀(Thermo賽默飛世爾);高速臺式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus);Western blot檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司);高純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng) 將人腹膜間皮細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中并采用DMEM的高糖培養(yǎng)基中(含有1%的雙抗,10%的胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長24 h。細(xì)胞生長密度達(dá)到90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代操作:細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)至超凈工作臺內(nèi),傾去細(xì)胞培養(yǎng)基,加入適量的PBS進(jìn)行潤洗2次,加入胰酶消化2-3 min,加入培養(yǎng)基終止消化,離心5 min得到細(xì)胞沉淀,按照1 ∶3比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞活力 HPMCs異常增殖與活化是腹膜纖維化的關(guān)鍵因素。為此,我們通過TGF-β1(0,5,10 μg/L)處理HPMCs檢測其對細(xì)胞活力的影響,以得到合適的處理濃度。①將HPMCs細(xì)胞按照密度為1×104/孔種于96孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁生長12 h,傾去原培養(yǎng)基,加入終濃度為0,5,10 μg/L TGF-β1,并分別設(shè)為control組、5 μg/L組、10 μg/L組,每組均設(shè)置6個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24 h;②避光條件下,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,混合均勻,并于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h;③單功能酶標(biāo)儀設(shè)置檢測波長為490 nm測定各孔吸光度值;④依據(jù)各孔吸光度值進(jìn)行OD值處理,細(xì)胞活力(%)=(試驗(yàn)組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)×100。

1.2.3 免疫熒光染色 采用10 μg/L TGF-β1處理24 h的HPMCs細(xì)胞免疫熒光檢測α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)。操作步驟:①取出control組與10 μg/L組的HPMCs細(xì)胞,傾去培養(yǎng)基,PBS潤洗,4%的多聚甲醛固定5 min,PBS潤洗2次,每次3 min;②在含0.1% Triton X-100(24孔板50 μl)的PBS中進(jìn)行10 min的透膜處理,PBS洗2次,每次5-10 min。手動輕輕晃動數(shù)次,吸盡液體;③羊血清用PBS配制成4%羊血清封閉液,室溫封閉(24孔板50 μl)30 min;④吸盡液體,勿洗,添加一抗(E-cadherin和α-SMA)(1 ∶200),于37 ℃條件下孵育1 h或放在4 ℃冰箱過夜,PBS洗3次,每次5-10 min;⑤去除一抗后,細(xì)胞用PBS洗3次;⑥滴加熒光素標(biāo)記的二抗,避光,37 ℃,60 min,PBS沖洗,5 min×3次;⑦防淬滅封片劑封片,4 ℃,避光保存;⑧熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 DDR1-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)DDR1基因序列,由廣州銳博基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成,將DDR1-siRNA及無關(guān)片段采用Qiagen Atractene Transgection轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至人腹膜間皮細(xì)胞中,并分為NC-siRNA組(HPMCs細(xì)胞采用轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA無關(guān)片段)、DDR1-siRNA組(HPMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA)、TGF-β1組(10 μg/L TGF-β1處理HPMCs細(xì)胞)、TGF-β1+DDR1-siRNA組(10 μg/L TGF-β1處理后的HPMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA 24 h),采用real-time PCR及Western blot篩選出可以有效抑制DDR1表達(dá)的siRNA片段用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR) 按照廣州銳博公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

名稱上游引物 下游引物 DDR15′-CATCTTTACTGCTGCTGCTCTTGG-3′5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′β-actin5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) α-SMA和E-cadherin是HPMCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白。為探究TGF-β1對HPMCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,我們通過Western blot檢測不同濃度的TGF-β1對DDR1、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)變化。①細(xì)胞裂解:收集HPMCs細(xì)胞,除去細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS潤洗1-2次,離心得到細(xì)胞沉淀物,加入細(xì)胞裂解液(1 ∶5)冰上裂解1 h;②蛋白質(zhì)濃度測定:高速離心機(jī)4 ℃,12 000g離心15 min,收集HPMCs細(xì)胞上清液,采用BCA法蛋白質(zhì)濃度定量檢測;③凝膠電泳:80 V,30 min后轉(zhuǎn)為120 V,60 min直至溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層;④轉(zhuǎn)膜:依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小進(jìn)行切膠,濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜時長約為2 h;⑤封閉:采用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h;⑥孵育一抗:孵育對應(yīng)一抗(DDR1、E-cadherin和α-SMA)(1 ∶1 000)4 ℃過夜;⑦孵育二抗:按照1 ∶5 000稀釋比例,室溫條件下孵育對應(yīng)的二抗約1 h;⑧顯影并拍照:搖床搖晃加入TPBS洗滌3次,每次5 min,后加入顯影液,顯影;顯影結(jié)果以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測TGF-β1對HPMCs活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:伴隨TGF-β1處理濃度的增加,HPMCs細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05或P<0.01,見圖1)。在TGF-β1處理HPMCs濃度為10 μg/L時,細(xì)胞活力增加最為顯著。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 CCK-8檢測TGF-β1對HPMCs活力的影響Figure 1 The effect of TGF-β1 on HPMCs activity detected by CCK-8

2.2 Western blot檢測TGF-β1對HPMCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示:相比于對照組,不同濃度TGF-β1處理組α-SMA顯著上調(diào)(P<0.01),E-cadherin明顯下調(diào)(P<0.01,見圖2)。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用10 μg/L濃度處理HPMCs。

2.3 免疫熒光檢測α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)

免疫熒光檢測結(jié)果顯示,TGF-β1(10 μg/L)處理HPMCs可以上調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)(P<0.01),下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.01,見圖3)。

2.4 RT-PCR和Western blot檢測TGF-β1對HPMCs中DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示:TGF-β1處理可以顯著上調(diào)DDR1 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.01,見圖4)。

與control組比較,**P<0.01圖2 TGF-β1對α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of TGF-β1 on the expression of α-SMA and E-cadherin proteins

與control組比較,**P<0.01圖3 免疫熒光檢測α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá) (×100)Figure 3 Expression of α-SMA and E-cadherin by immunofluorescence (×100)

與control組比較,**P<0.01圖4 DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)變化Figure 4 expression changes of DDR1 mRNA and protein

2.5 DDR1 siRNA對HPMCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染DDR1 siRNA后可以顯著抑制DDR1蛋白表達(dá)(P<0.01),下調(diào)α-SMA的表達(dá),上調(diào)E-cadherin的表達(dá)(P<0.01,見圖5)。

與NC-siRNA組比較,**P<0.01;與TGF-β1組比較，##P<0.01圖5 DDR1 siRNA對HPMCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure 5 Effect of DDR1 siRNA on epithelial mesenchymal transformation of HPMCs

3 討論

腹膜透析是終末期腎病的一種有效性替代療法,約10%-15%的終末期腎病患者首選該方案進(jìn)行治療[12]。伴隨慢性腎臟疾病的發(fā)病率增加,腹膜透析的患者也越發(fā)增多。腹膜纖維化是腹膜透析患者長期的一種病理學(xué)變化,其中炎癥介質(zhì)以及TGF-β1是引發(fā)腹膜纖維化的重要因素。研究發(fā)現(xiàn),在PD患者的腹膜透析液中TGF-β1的表達(dá)水平顯著性升高,其表達(dá)水平的高低與腹膜惡化的程度呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。在小鼠動物模型中,通過注射攜帶TGF-β1基因的腺病毒可誘導(dǎo)小鼠腹膜纖維化[14]。由此可見,TGF-β1在腹膜纖維化中發(fā)揮重要作用。對此,本研究前期通過培養(yǎng)HPMCs細(xì)胞,外源性TGF-β1(0,5,10 μg/L)處理細(xì)胞24 h。CCK-8檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn),伴隨TGF-β1處理濃度的提高,細(xì)胞活力呈現(xiàn)遞增。Western blot檢測纖維化相關(guān)蛋白結(jié)果顯示,α-SMA表達(dá)上調(diào),E-cadherin表達(dá)下調(diào)。我們進(jìn)一步利用免疫熒光檢測α-SMA和E-cadherin表達(dá),結(jié)果與Western blot結(jié)果一致,α-SMA表達(dá)上調(diào),E-cadherin表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果共同表明,TGF-β1可誘導(dǎo)HPMCs細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。但有關(guān)其分子作用機(jī)制尚不完全清晰。

DDR1是一種新型受體酪氨酸蛋白激酶,廣泛參與了組織纖維化進(jìn)程。其可以與特異性膠原結(jié)合進(jìn)而激活DDR1活性,促進(jìn)下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠的乳腺癌上皮細(xì)胞中,基因沉默DDR1可以降低EMT[16]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中,過表達(dá)DDR1基因可以促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[17]。在腎臟纖維化中,通過基因敲除DDR1可以降低腎臟TGF-β1表達(dá),緩解腎臟纖維化[18]。以上研究表明,在組織纖維化中,DDR1可能與TGF-β1存在上下游的分子作用關(guān)系。為此,我們通過RT-PCR和Western blot檢測DDR1表達(dá)水平，結(jié)果顯示,TGF-β1處理組DDR1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著性升高。進(jìn)一步敲低DDR1后檢測α-SMA和E-cadherin表達(dá),結(jié)果顯示,相比于TGF-β1處理組,轉(zhuǎn)染DDR1 siRNA后α-SMA表達(dá)顯著降低,E-cadherin表達(dá)顯著性升高。由此表明,在TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCs細(xì)胞EMT過程中DDR1可能參與纖維化的進(jìn)程,導(dǎo)致腹膜纖維化。

綜上所述,DDR1參與了TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCs細(xì)胞EMT過程,加快腹膜纖維化的進(jìn)程。但是,在本研究中未能深入研究DDR1誘導(dǎo)纖維化的下游分子信號通路。因此,在后續(xù)的研究中,我們將通過在體動物與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共同研究DDR1介導(dǎo)腹膜纖維化的下游分子機(jī)制,進(jìn)而為靶向抑制DDR1改善腹膜纖維化開拓新的分子機(jī)制。