代 瑩,包 驥,許 波,姜媛媛,邱海燕,黃 藝,詹發(fā)平

(1興義市人民醫(yī)院腫瘤科,興義 562400;2四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院病理科;3興義市人民醫(yī)院普通外科)

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位,病死率位居第2位[1,2]。近年來(lái),結(jié)腸癌發(fā)生率逐年升高,已成為我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人民生命健康[3],患者5年生存率不足60%[4]。因此,探討結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)腫瘤的靶向治療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是內(nèi)源性的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA,通過(guò)抑制靶基因翻譯或降解靶基因mRNA,參與機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化等[5]。miR-152是miR-148/152的成員之一,參與一系列細(xì)胞活動(dòng),例如細(xì)胞增殖、入侵等,在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[6,7]。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是胰島素受體、類胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ受體的重要底物,通過(guò)將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi),調(diào)控細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、存活、分化和惡性轉(zhuǎn)化[8]。目前,miR-152和IRS-1對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響尚不明確。本研究旨在探討miR-152與IRS-1的關(guān)系及對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷徙、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、胰蛋白酶、化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、IRS-1抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、MMP-9抗體、β-actin抗體購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司;熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;TRIzol試劑、CCK-8試劑、羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;Transwell小室購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司;MatrigelTM基質(zhì)膠購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。熒光定量PCR儀(ABI 7500)為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品;全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX800)為美國(guó)BIO-TEK公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiDocXRS)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將結(jié)腸癌細(xì)胞SW480接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2的恒溫飽和濕度培養(yǎng),細(xì)胞融合率達(dá)到約80%時(shí),用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期SW480細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl,用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將nonsense siRNA載體和miR-152 siRNA載體轉(zhuǎn)入到SW480細(xì)胞中,分別命名為無(wú)義轉(zhuǎn)染組和miR-152 siRNA組,不轉(zhuǎn)入任何載體的SW480細(xì)胞為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24 h將各組SW480細(xì)胞正常培養(yǎng),待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 qRT-PCR法檢測(cè)SW480細(xì)胞中miR-152和IRS-1 mRNA表達(dá)

將對(duì)照組、無(wú)義轉(zhuǎn)染組和miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-152和IRS-1 mRNA表達(dá)水平,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。反應(yīng)程序:95 ℃ 15 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,循環(huán)45次;72 ℃ 10 min。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),miR-152和IRS-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.4 CCK-8法檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖

將對(duì)照組、無(wú)義轉(zhuǎn)染組和miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞培養(yǎng)48 h,加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。

1.5 Transwell法檢測(cè)SW480細(xì)胞遷徙

用無(wú)血清培養(yǎng)液將對(duì)照組、無(wú)義轉(zhuǎn)染組和miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞稀釋為2.5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,分別向Transwell小室上層加入200 μl,下室中均加入500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,用無(wú)菌棉簽擦去小室膜上未穿膜的細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定下層遷徙細(xì)胞10 min,PBS洗滌,用0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min,PBS洗滌。倒置顯微鏡隨機(jī)選取6個(gè)視野(×200)觀察拍照,統(tǒng)計(jì)遷徙細(xì)胞數(shù)并計(jì)算平均值。

1.6 Transwell法檢測(cè)SW480細(xì)胞侵襲

用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(1 ∶8),向每個(gè)Transwell小室中加50 μl,37 ℃ 1 h凝固。后續(xù)操作均與1.5中檢測(cè)細(xì)胞遷徙情況步驟相同,隨機(jī)選6個(gè)視野統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot法檢測(cè)SW480細(xì)胞IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

將對(duì)照組、無(wú)義轉(zhuǎn)染組和miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白,使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度并定量。電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入IRS-1、PCNA、MMP-2、MMP-9、β-actin抗體(1 ∶500),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌,加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析,目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SW480細(xì)胞中miR-152和IRS-1 mRNA表達(dá)水平

對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞中miR-152、IRS-1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞中miR-152表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),IRS-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

2.2 SW480細(xì)胞增殖情況

對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

2.3 SW480細(xì)胞遷徙情況

對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞遷徙細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞遷徙細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,bP<0.05圖1 各組SW480細(xì)胞中miR-152、IRS-1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 1 Expression levels of miR-152 and IRS-1 mRNA in SW480 cells after different treatment

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,bP<0.05圖2 各組SW480細(xì)胞OD值比較Figure 2 OD values in SW480 cells after different treatment

2.4 SW480細(xì)胞侵襲情況

對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,bP<0.05圖3 各組SW480細(xì)胞遷徙細(xì)胞數(shù)比較Figure 3 Migrated cell numbers in SW480 cells after different treatment

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,bP<0.05圖4 各組SW480細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較Figure 4 Invasion cell numbers in SW480 cells after different treatment

2.5 SW480細(xì)胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)情況

對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,miR-152 siRNA組SW480細(xì)胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與無(wú)義轉(zhuǎn)染組相比,bP<0.05圖5 SW480細(xì)胞中IRS-1、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況Figure 5 Expression levels of IRS-1,PCNA,MMP-2 and MMP-9 protein in SW480 cells after different treatment

3 討論

結(jié)腸癌是原發(fā)于直腸或結(jié)腸的惡性腫瘤,中、晚期極易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移,但是由于結(jié)腸癌早期容易被忽視,多數(shù)患者確診時(shí)伴有局部或遠(yuǎn)處侵襲、轉(zhuǎn)移[9,10]。臨床研究表明,已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者通常無(wú)法治愈,目前主要依靠手術(shù)和化療改善生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間,但平均總生存時(shí)間依舊偏低[5]。相對(duì)于傳統(tǒng)化療藥物,分子靶向治療的特異性更強(qiáng)、副作用更小,但臨床上缺乏結(jié)腸癌的有效分子靶向藥物[11,12]。因此,調(diào)控結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制和治療結(jié)腸癌的有效靶點(diǎn)的研究仍是目前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱門區(qū)域。

結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及到多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)異常[13]。而miRNA表達(dá)異常是其中的重要環(huán)節(jié),已被證實(shí)參與癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程,通常能作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物和腫瘤靶向治療靶點(diǎn)[14]。研究表明,miRNA與靶基因mRNA上的非編碼區(qū)域(R內(nèi)含子區(qū)域或3′-UT)不完全或完全互補(bǔ)配對(duì),通過(guò)降解靶基因或抑制靶基因的翻譯,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織發(fā)育等多種生理病理過(guò)程[5]。miR-152是miR-148/152家族的一員,據(jù)報(bào)道,miR-152在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用。倪莎等[15]研究表明,miR-152可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Mirk/Dyrk1B影響人卵巢癌干細(xì)胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行?。研究[16,17]表明,miR-152通過(guò)抑制CDC25B或WNT1、ERBB3的表達(dá),抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示,沉默SW480細(xì)胞中miR-152表達(dá)后,SW480細(xì)胞OD值、遷徙細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高,提示miR-152在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中同樣發(fā)揮抑癌作用,抑制miR-152表達(dá)后可促進(jìn)SW480細(xì)胞的增殖、遷徙與侵襲,但在SW480細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

IRS-1是胰島素底物家族中的胰島素受體酪氨酸激酶底物,是胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最重要的底物,參與激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化及遷移的作用[18]。李楠等[19]研究表明,IRS1可被miR-126靶向調(diào)控表達(dá)下調(diào),抑制結(jié)腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。Xu等[20]研究表明,過(guò)度表達(dá)miR-148a/mir-152通過(guò)靶向IGF-IR、IRS-1并抑制其下游AKT、MAPK/ERK信號(hào)通路,顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、集落形成和腫瘤血管生成。本研究結(jié)果顯示,沉默SW480細(xì)胞中miR-152表達(dá)后,SW480細(xì)胞中IRS-1 mRNA水平顯著上升,提示結(jié)腸癌中miR-152可能靶向調(diào)控IRS-1 mRNA表達(dá)發(fā)揮作用,這與Xu等[20]在乳腺癌細(xì)胞中的研究一致,當(dāng)沉默SW480中miR-152表達(dá)后,IRS-1表達(dá)上調(diào)參與SW480細(xì)胞增殖、遷徙、侵襲。

PCNA是增殖相關(guān)基因,參與SW480細(xì)胞增殖過(guò)程[21]。MMP-2、MMP-9是鋅離子依賴的蛋白水解酶家族MMP家族成員,在腫瘤細(xì)胞侵襲中發(fā)揮重要作用[22]。本研究結(jié)果顯示,沉默SW480細(xì)胞中miR-152表達(dá)后,SW480細(xì)胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高,提示沉默SW480中miR-152表達(dá)后,上調(diào)IRS-1表達(dá)的同時(shí),影響PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖、遷徙與侵襲。

綜上所述,miR-152可能靶向IRS-1表達(dá),抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷徙及侵襲過(guò)程。但結(jié)腸癌增殖、遷徙、侵襲途徑復(fù)雜,還需進(jìn)一步探究miR-152靶向IRS-1過(guò)程涉及到的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,及在不同結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用途徑,以期為治療結(jié)腸癌提供有效靶點(diǎn)。