武玉珍,李敏,李曉科,張峰

(1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山西 晉中 030600;2.太原師范學(xué)院 生物系,山西 晉中 030600;3.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)是我國特有的珍稀鳥類,已被國際自然與自然資源保護(hù)聯(lián)盟和國際鳥盟定為全球性瀕危物種,列入《世界瀕危鳥紅皮書》,是國家Ⅰ級保護(hù)鳥類[1-2]。褐馬雞主要分布在山西省、陜西省、河北省和北京市等省市的部分林區(qū)[3],山西是褐馬雞分布中心和多度中心,主要集中在呂梁山脈。山西靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)位于太岳山脈中段。2005年1月，太岳林局勘測隊首次在古縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)了野生褐馬雞蹤跡，2007年4月首次在沁源縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)了4只野生褐馬雞,此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多個褐馬雞種群。目前山西靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)有12個自然群,種群數(shù)量為160只～210只[4]。對于這一新發(fā)現(xiàn)的褐馬雞地理種群的研究目前主要在資源分布、棲息地環(huán)境調(diào)查等[5],種群遺傳多樣性的研究未見報道。

本文采用線粒體DNA分子標(biāo)記對靈空山保護(hù)區(qū)褐馬雞個體的線粒體控制區(qū)(mtDNA D-loop)以及線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因全序列進(jìn)行測定與分析,對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性、親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析,以期為靈空山自然保護(hù)區(qū)褐馬雞的研究與保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗材料:本實(shí)驗所用樣品來自山西靈空山自然保護(hù)區(qū)救護(hù)站4只成年褐馬雞(從野外撿回來的褐馬雞蛋孵化的,可以代表野生種群),采集血液樣本,樣本號分別為1、3、4、5,樣本2缺失。

1.2 方法

1.2.1 褐馬雞血液樣品DNA提取

使用天根生化科技有限公司的血液基因組提取試劑盒進(jìn)行抽提,抽提后分別用微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。按照文獻(xiàn)[6]設(shè)計PCR擴(kuò)增引物(表1),分別擴(kuò)增褐馬雞的線粒體DNA D-loop和Cytb。

用M13F和M13R對重組子進(jìn)行測序,雙向測序結(jié)果拼接后,去掉載體序列,獲得目的基因序列,測序儀的型號是ABI 3130XL。

表1 引物設(shè)計表

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

用ClustalX 2.0的Align程序進(jìn)行DNA同源序列排列,并人工核對校正。通過DNAsp和MEGA7.0.26軟件計算出褐馬雞4只個體間的遺傳多樣性參數(shù)及個體之間的遺傳距離并分別以采用最大似然法(ML)、鄰接法(NJ)進(jìn)行建樹。將上述目的片斷在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行BLAST同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成

對靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)褐馬雞種群4個樣本mtDNA D-Loop和Cytb全序列進(jìn)行了檢測,獲得序列片斷長度為1 238 bp和1 458 bp,見表2。

表2 山西靈空山褐馬雞種群線粒體D-loop區(qū)和Cyt b基因的平均堿基組成

從表2可以看出,D-loop序列中堿基組成 T、C、A和G的平均質(zhì)量百分含量分別為 30.9%、27.5%、26.9%和14.7%,其中 A+T質(zhì)量百分含量(57.8%)高于G+C質(zhì)量百分含量(41.9%),表現(xiàn)出顯著的堿基組成偏向性;Cytb序列中,堿基組成T、C、A、G的平均質(zhì)量百分含量分別為29.4%、12.7%、24.6%、33.4%,其中A+T質(zhì)量百分含量(54.0%)高于G+C質(zhì)量百分含量(46. 1%),堿基組成偏向性不顯著。

2.2 序列變異特征

用分子進(jìn)化遺傳分析軟件——MEGA7.0.26確定多態(tài)位點(diǎn)。對本研究所測定的4條褐馬雞mtDNA控制區(qū)和Cytb全序列進(jìn)行比較,分析序列的變異位點(diǎn)。

如表3所示,4只褐馬雞的mtDNA D-loop序列(1 238 bp) 中,共檢測到7個變異位點(diǎn),7個變異位點(diǎn)共定義了3種單倍型,變異位點(diǎn)分別在:22、30、517、547、699、1 051和1 177的堿基。

如表4所示,4只個體的Cytb中有6個變異位點(diǎn),6個變異位點(diǎn)共定義了2個單倍型,變異位點(diǎn)分別在:90、144、350、585、610和1 350堿基處。全部位點(diǎn)為兩堿基間突變。

表3 基于D-loop序列靈空山褐馬雞種群4只個體的變異位點(diǎn)

表4 基于Cyt b序列靈空山褐馬雞種群4只個體的變異位點(diǎn)

2.3 遺傳多樣性

種群遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計見表5。從表5可以看出,兩條序列D-loop和Cytb褐馬雞單倍型多樣性(h)平均值分別為0. 833和0.5;核苷酸多樣性平均值(π) 分別為0. 002 83和0.002 06;平均的核苷酸差異數(shù)分別為3.5和3,兩條序列的遺傳多樣性參數(shù)表明:靈空山自然保護(hù)區(qū)褐馬雞有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性,且D-loop序列的遺傳多樣性指數(shù)較Cytb序列的遺傳多樣性指數(shù)較高。

2.4 遺傳距離

不同個體間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離見表6和表7。結(jié)果表明:4只個體間遺傳距離的范圍為D-loop區(qū)0. 000～0. 006,D-loop的平均遺傳距離為:0.003。Cytb4只個體間遺傳距離的范圍為0. 000～0. 004,Cytb平均遺傳距離0.002。

表5 靈空山褐馬雞種群線粒體D-loop區(qū)和Cyt b基因的遺傳參數(shù)

表6 基于線粒體D-loop序列的靈空山褐馬雞種群4只個體之間的遺傳距離

從表6可以看出:基于線粒體D-loop的褐馬雞種群內(nèi)的遺傳距離,個體4和個體5之間的遺傳距離最大為:0.006,其次是個體4與個體1、3之間的遺傳距離為:0.004;而個體5和個體1、3之間遺傳距離為0.002;個體1和個體3之間遺傳距離最近為0.000。

表7 基于線粒體Cyt b序列的靈空山褐馬雞種群4只個體之間的遺傳距離

從表7可以看出:基于線粒體Cytb的褐馬雞種群內(nèi)的遺傳距離,個體3和個體1、4、5之間距離最大為0.004,個體5和個體1、4之間遺傳距離最近為0.000。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用Mega 7.0軟件,基于褐馬雞mtDNA控制區(qū)和Cytb全序列的Kimura 雙參數(shù)遺傳距離,利用NJ法構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹,見圖1和圖2。

從圖1可以看出:個體4和個體5之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),個體4和個體1、3之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),個體5和個體1、3之間的親緣關(guān)系較近,而個體1和個體3之間無變異,親緣關(guān)系最近。

由圖2可以看出:個體3和個體1、4、5之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),而個體5和個體1、4之間的親緣關(guān)系最近。綜上所述:遺傳距離近的個體之間,親緣關(guān)系近;遺傳距離遠(yuǎn)的個體之間,親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

圖1 基于D-loop序列用NJ法構(gòu)建的靈空山自然保護(hù)區(qū)褐馬雞4個個體的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 基于Cyt b序列用NJ法構(gòu)建的靈空山自然保護(hù)區(qū)褐馬雞4個個體的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

線粒體DNA(mtDNA)是生物體中唯一的細(xì)胞核外遺傳物質(zhì),以母系遺傳方式遺傳。其結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定、世代間沒有基因重組且進(jìn)化速度較快,能夠更直觀保存群體突變的發(fā)生[7],mtDNA 比核位點(diǎn)更易受遺傳漂變的影響[8]。近幾年,以線粒體DNA作為分子標(biāo)記,研究物種的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)起到很重要的作用。線粒體基因組通常有一個負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)即控制區(qū),線粒體控制區(qū)(D-loop)的進(jìn)化比mtDNA中的其他區(qū)域快5～10倍[9],具有堿基替換速率快、存在豐富的序列變異等特點(diǎn),特別適合于檢測種群內(nèi)及種群間的遺傳多樣性。由于線粒體DNA控制區(qū)的高突變率,有時很短的擴(kuò)增片段即可解決保護(hù)遺傳學(xué)中所關(guān)注的問題,這對于瀕危物種有著突出的意義,因為這類物種的基因材料往往很難獲得。細(xì)胞色素b基因(Cytb)是線粒體13個蛋白編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能被研究得最為清楚的基因之一,且進(jìn)化速度適中,適合種群水平差異的檢測[10-12]。所以用這兩種分子標(biāo)記不僅可以了解種群的遺傳多樣性,還可以探討其形成特定遺傳結(jié)構(gòu)的歷史原因和地理原因[13-15]。由于線粒體基因組具有母系遺傳、多拷貝、缺少遺傳重組以及進(jìn)化速率快等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于比較基因組學(xué)、分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育重建、譜系地理學(xué)及種群遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域[16-19]。

褐馬雞是中國特有的瀕危鳥類,目前僅分布在河北小五臺山、北京東靈山、陜西黃龍山和山西的呂梁山脈,因為太行山和黃河的阻隔,形成了三個孤立的地理種群,即河北、北京的東部種群,陜西的西部種群和山西的中部種群。靈空山是近年來新發(fā)現(xiàn)的褐馬雞分布區(qū),對這一區(qū)域褐馬雞種群的來源和遺傳背景的研究尚屬空白。付玉明[20]對河北小五臺山與山西蘆芽山、龐泉溝褐馬雞種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示三個區(qū)域的種群遺傳多樣性均較低,小五臺山種群與蘆芽山、龐泉溝種群之間已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的遺傳分化,蘆芽山和龐泉溝種群之間沒有顯著的遺傳分化。武玉珍[21-25]等對龐泉溝自然保護(hù)區(qū)和太原市動物園的褐馬雞種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示褐馬雞種群表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性,說明山西分布的褐馬雞種群的遺傳多樣性較低,但卻存在廣泛的個體間遺傳變異。本研究實(shí)驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果和上面的研究結(jié)果相似,靈空山自然保護(hù)區(qū)褐馬雞種群具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性,預(yù)示著群體曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)后,伴隨了迅速的種群擴(kuò)張與變異的積累。通過遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹分析了各個個體之間的親緣關(guān)系。以線粒體DNA的D-loop為分子標(biāo)記的結(jié)果顯示4只個體有3個單倍型,序列的變異位點(diǎn)數(shù)5,平均核苷酸的差異數(shù)為3.5,都較以線粒體DNA的Cytb為分子標(biāo)記的指數(shù)較高,這可能是由于兩個分析標(biāo)記的差異所致。本研究由于取樣地點(diǎn)和數(shù)量的限制,對褐馬雞遺傳多樣性水平的評價還不夠全面,需在以后的工作中進(jìn)一步加以完善。

褐馬雞在我國分布范圍較小,山西省呂梁山脈是現(xiàn)有野生褐馬雞的分布中心和多度中心,其他分布區(qū)的種群數(shù)量和分布范圍相對較小。山西靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)地處太岳山脈中段,近二百年來沒有褐馬雞分布的記錄[26],但追溯歷史文獻(xiàn)卻有褐馬雞的記載。漢許慎《說文解字·鳥部 》:“鹖,似雉,出上黨,從鳥,曷聲”。晉代徐廣:“鹖似黑雉,出于上黨”。可見漢晉的學(xué)者一直認(rèn)為上黨是鹖的主要產(chǎn)地。據(jù)清雍正八年《沁源縣志》、康熙十二年和乾隆二十八年《長治縣志》、雍正十二年《山西通志·潞安府》都記載有“鹖”。沁源屬沁州,長治屬潞安府,潞安府和沁州都是上黨郡的一部分,說明歷史上這一帶曾經(jīng)有褐馬雞的分布,一直延續(xù)至清代前期,大約在十八世紀(jì)以后就銷聲匿跡[27]。歷史記載山西東南部太岳山與太行山是褐馬雞的盛產(chǎn)地。山西靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)距離有褐馬雞分布最近的山西五鹿山國家級自然保護(hù)區(qū)約80 km,并有汾河相隔,有人推斷靈空山的褐馬雞是從五鹿山擴(kuò)散而來。但褐馬雞是留鳥,善奔跑會滑翔,不善飛翔,最大擴(kuò)散距離約 5.7 km[28]。褐馬雞是否跨越汾河、翻越崇山峻嶺,從呂梁山脈南端來到太岳山脈中段,還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

與此相似,作為褐馬雞西部種群所處的陜西黃龍山國家級自然保護(hù)區(qū),1998年多個國家聯(lián)合調(diào)查組查驗證實(shí)黃龍山林區(qū)是褐馬雞的實(shí)際分布區(qū)[29],種群數(shù)量近2 000只[30],譽(yù)為陜西省野生動物保護(hù)史上四次重大發(fā)現(xiàn)之一[31]。據(jù)史料記載,明朝以前的史籍考證表明,陜北黃土高原的廣大地區(qū)曾有大量的褐馬雞分布[32]。陜西黃龍山國家級自然保護(hù)區(qū)距離最近的褐馬雞分布區(qū)山西省五鹿山自然保護(hù)區(qū)有100多公里,且有黃河相隔。黃龍山褐馬雞種群是由山西省擴(kuò)散遷移去的,還是本地的固有地理種群,目前尚有爭議[33],需要進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)證。

靈空山和黃龍山雖然都有史料記載是褐馬雞的主要分布區(qū),但也有近二百年的歷史空缺,要做出明確的結(jié)論還需要進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)證。

致謝山西靈空山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局和山西沃成生態(tài)研究所給予采取樣品的幫助,特此致謝。