常瀚文 鄭鑫鈴 駱健美 王敏 申雁冰

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)）天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

微生物作為細(xì)胞工廠能夠?qū)⒏鞣N原料轉(zhuǎn)化生成藥物、生物燃料、生物材料和化學(xué)品。但生產(chǎn)過(guò)程中，菌株常常面臨各種脅迫條件，如極端的溫度和pH、滲透壓、氧化壓力、有機(jī)溶劑、高濃度底物、有毒的產(chǎn)物或副產(chǎn)物等。在這些脅迫條件下，菌株的生長(zhǎng)性能和代謝活力明顯受到抑制，有時(shí)甚至完全喪失，這嚴(yán)重影響了其生產(chǎn)效率。因此，強(qiáng)化菌株的脅迫耐受性（也稱魯棒性）是提高微生物細(xì)胞工廠產(chǎn)量（Titer）、轉(zhuǎn)化率（Yield）和生產(chǎn)速率（Productivity）的迫切需要。

圖1 微生物在脅迫條件下的主要適應(yīng)行為

提高菌株脅迫耐受性的傳統(tǒng)方法主要包括馴化和物理化學(xué)誘變，但這些方法存在周期長(zhǎng)、工作量大、人力和物力投入較大、定向性差、優(yōu)良表型易丟失且難以進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移等缺點(diǎn)。相比之下，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)導(dǎo)入或改造抗逆元件是更為直接和有效的方法。大量研究表明，微生物脅迫條件下的適應(yīng)行為非常復(fù)雜，與細(xì)胞的組成結(jié)構(gòu)、生理性質(zhì)、代謝途徑和調(diào)控過(guò)程等密切相關(guān)，如細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、細(xì)胞形態(tài)、外排泵、熱激蛋白、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、相容性溶質(zhì)、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等（圖1）。更值得注意的是，微生物的適應(yīng)行為不僅依賴于具體的脅迫條件（如脅迫的種類和劑量），還表現(xiàn)出明顯的菌種特異性（革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、酵母和其他真菌等）和菌株特異性（同一個(gè)種的不同菌株有時(shí)表現(xiàn)出完全不同的適應(yīng)行為），有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)完全相反的情況，這大大提高了抗逆元件挖掘和應(yīng)用的難度。目前，抗逆元件篩選的一般方法主要包括：（1）出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株的基因組測(cè)序分析；（2）出發(fā)菌株或進(jìn)化菌株在無(wú)/有脅迫條件下的各種組學(xué)數(shù)據(jù)（如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)）分析；（3）天然耐受菌株的基因組文庫(kù)構(gòu)建（圖2）?？鼓嬖膽?yīng)用領(lǐng)域也從典型的模式微生物逐步擴(kuò)展到非模式微生物或工業(yè)生產(chǎn)菌株。本文將著重綜述近年來(lái)抗逆元件及其在高效微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用實(shí)例，并探討存在的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

圖2 抗逆元件篩選的主要方法和一般過(guò)程

1 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜調(diào)控相關(guān)基因

表1匯總了近年來(lái)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜調(diào)控相關(guān)基因在改善微生物脅迫耐受性及其生產(chǎn)性能方面的研究進(jìn)展。

1.1 細(xì)胞壁合成和代謝相關(guān)基因

細(xì)胞壁是微生物與外界環(huán)境分隔的重要生物學(xué)屏障。UDP-N-乙酰胞壁酸（UNAM）是原核生物細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖的合成前體之一，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶（MurA）是合成該物質(zhì)的關(guān)鍵酶。研究者利用一株耐醇性能優(yōu)良的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的已知基因組信息，通過(guò)Cre-lox系統(tǒng)在大腸桿菌（Escherichia coli）染色體上進(jìn)行隨機(jī)整合，構(gòu)建整合型突變文庫(kù)篩選乙醇抗逆基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌來(lái)源的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶的murA2基因的過(guò)表達(dá)不僅增強(qiáng)了大腸桿菌MG1655對(duì)乙醇、正丁醇、異丁醇的耐受性，而且使乙醇工業(yè)生產(chǎn)菌株大腸桿菌KO11在發(fā)酵過(guò)程中保持良好活力，進(jìn)而合成更多的乙醇［1］。

1.2 細(xì)胞膜合成和代謝相關(guān)基因

細(xì)胞膜是外界脅迫條件作用細(xì)胞的主要靶點(diǎn)，也為酶的組裝和功能提供合適的基質(zhì)。細(xì)胞膜脂的主要成分包括磷脂、鞘脂、甾醇和膜蛋白，其組成和結(jié)構(gòu)的變化直接影響細(xì)胞膜的完整性（Integrity）、流動(dòng)性（Fluidity）和通透性（Permeability）。近年來(lái)，細(xì)胞膜合成和代謝相關(guān)基因的操作在增強(qiáng)微生物脅迫條件下的耐受性，進(jìn)而改善其生產(chǎn)性能方面表現(xiàn)出良好的效果。

美國(guó)愛(ài)荷華州立大學(xué)的Jarboe課題組分別通過(guò)磷脂酰絲氨酸合酶PssA［2］和順?lè)串悩?gòu)酶Cti的表達(dá)［3］，證實(shí)了磷脂酰乙醇胺（PE）和反式不飽和脂肪酸含量的增加均能增強(qiáng)大腸桿菌MG1655對(duì)C8有機(jī)酸的耐受性，進(jìn)而提高菌株的辛酸和總脂肪酸產(chǎn)量。其中，PssA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的耐受性增加主要與細(xì)胞膜完整性的增加、胞內(nèi)pHi的提高（PE的增加抑制了C8進(jìn)入細(xì)胞膜疏水核心區(qū)）、細(xì)胞膜和疏水核心區(qū)厚度的增大密切相關(guān)。而來(lái)源于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Cti的表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞膜剛性，對(duì)細(xì)胞膜厚度和完整性沒(méi)有影響。PssA過(guò)表達(dá)最優(yōu)菌株對(duì)酸處理木質(zhì)纖維素過(guò)程中產(chǎn)生的相關(guān)抑制劑（如呋喃類化合物、弱羧酸類化合物和酚類單體等）也表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，進(jìn)而產(chǎn)生更多的辛酸和總脂肪酸。兩個(gè)工程菌株對(duì)其他生物產(chǎn)品的耐受性也明顯增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了更多產(chǎn)物的合成（如Cti表達(dá)菌株的苯乙烯產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了10.4%）。值得注意的是，它們對(duì)主要的工業(yè)生產(chǎn)脅迫條件也表現(xiàn)出更高的耐受性。

II型脂肪酸（FAS II）合成過(guò)程中4個(gè)相關(guān)基因fabA、fabB、fabD、fabF的過(guò)表達(dá)能提高大腸桿菌MDB5菌株的正丁醇耐受性。但這些基因在調(diào)控菌株的醇類物質(zhì)耐受性方面表現(xiàn)出不同的效果。值得注意的是，脂肪酸合成速率重要限速酶FabD（丙二酸單酰CoA∶ACP轉(zhuǎn)?；福┑目截悢?shù)從1增加到3時(shí)，菌株的正丁醇耐受性明顯增強(qiáng)，當(dāng)拷貝數(shù)增大到4時(shí)，菌株的耐受性反而下降，這可能是因?yàn)榈鞍走^(guò)量表達(dá)容易引起聚集，從而降低其催化活性［4］。?；??；d體蛋白硫酯酶負(fù)責(zé)水解飽和或不飽和脂肪酸上的酰基-ACPs產(chǎn)生游離脂肪酸，因此，對(duì)胞內(nèi)脂肪酸合成的通量具有調(diào)控作用。但不同來(lái)源的硫酯酶具有不同的底物偏好性。地芽孢桿菌（Geobacillussp.）Y412MC10的硫酯酶（GeoTE）主要水解中等鏈長(zhǎng)、不飽和脂肪酸的?；鵄CPs。加州月桂（Umbellularia californica）的硫酯酶（BTE）主要水解飽和C12-?；鵄CPs，也能水解不飽和的C12、飽和或不飽和的C14-酰基ACPs。研究者將上述底物偏好性不同的硫酯酶分別導(dǎo)入大腸桿菌RL08ara后發(fā)現(xiàn)，GeoTE單獨(dú)表達(dá)菌株對(duì)游離脂肪酸表現(xiàn)出最強(qiáng)耐受性，這與其具有更好的細(xì)胞完整性和較低的不飽和脂肪酸含量密切相關(guān)。該菌株培養(yǎng)8 h后能合成更多的游離脂肪酸，但培養(yǎng)24 h后，脂肪酸產(chǎn)量反而低于BTE單獨(dú)表達(dá)菌株和GeoTE/BTE共表達(dá)菌株，這說(shuō)明存在著其他代謝或者調(diào)控障礙［5］。乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其突變體Acc1S1157A在釀酒酵母BY4741的表達(dá)使菌株的辛酸最小致死濃度提高1倍。這種耐受性的增強(qiáng)與脂肪酸鏈平均長(zhǎng)度增大和脂肪酸含量變化（如硬脂酸和油酸含量的增加、棕櫚酸和棕櫚油酸含量的下降）共同導(dǎo)致的細(xì)胞完整性增加密切相關(guān)。此外，突變菌株對(duì)其他高價(jià)值生物產(chǎn)品和各種膜抑制劑的耐受性也明顯增強(qiáng)［6］。2-?；?甘油磷酰乙醇胺?；D(zhuǎn)移酶/?；?ACP合成酶（Aas）是催化中鏈脂肪酸生成中鏈乙酰-ACPs，以及該中間物生成2-酰基-甘油磷酰乙醇胺（2-acyl-GPE）的關(guān)鍵酶，對(duì)于中鏈脂肪酸在細(xì)胞膜上的插入具有重要作用。大腸桿菌ΔfadD和ΔfadDBTE表達(dá)菌株中aas基因的敲除提高了菌株的中鏈脂肪酸耐受性，進(jìn)而提高了菌株合成中鏈脂肪酸的水平。這是因?yàn)閍as的敲除減少了游離中性脂肪酸在細(xì)胞膜磷脂的插入，使得脅迫下的細(xì)胞磷脂組成能恢復(fù)到正常水平。之后通過(guò)敲除aas和表達(dá)fadR的組合操作，中鏈脂肪酸的產(chǎn)量比出發(fā)菌株（大腸桿菌ΔfadDBTE）提高了約50%［7］。OLE1編碼的Ole1p（Δ-9-脂肪酸去飽和酶）催化飽和脂肪酸（如C16∶0和C18∶0）的去飽和反應(yīng)。它的過(guò)表達(dá)提高了釀酒酵母對(duì)醋酸等各種脅迫物質(zhì)的耐受性，但不能改變菌株對(duì)高溫和低溫的耐受性。該蛋白主要通過(guò)組成性激活高滲透壓甘油（High osmolarity glycerol，HOG）通路中的Hog1激酶，促進(jìn)質(zhì)子外排、增強(qiáng)細(xì)胞膜完整性和降低胞內(nèi)H2O2含量等方式提高菌株的脅迫耐受性［8］。非直鏈脂肪酸（如環(huán)丙烷脂肪酸和支鏈脂肪酸）含量的多少直接影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙烷脂肪酸合成酶（CFA）的表達(dá)通過(guò)提高環(huán)丙烷脂肪酸（cycC19∶0）及其前體物質(zhì)油酸的含量，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，增強(qiáng)了乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）亞種TOMSC161的冷凍和干燥脅迫耐受性［9］、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）JDY1017dpH和短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）的耐酸性［10］。

表1 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜調(diào)控相關(guān)基因改善宿主生物耐受性和生產(chǎn)性能的小結(jié)

甾醇類物質(zhì)是影響細(xì)胞膜剛性的重要組分。真菌麥角甾醇合成途徑的最后5步反應(yīng)的關(guān)鍵酶（C-24甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶Erg6、C-8甾醇異構(gòu)酶Erg2、C-5甾醇去飽和酶Erg3、C-24甾醇還原酶Erg4和C-22甾醇去飽和酶Erg5）編碼基因的敲除通過(guò)降低細(xì)胞膜的剛性，增強(qiáng)了釀酒酵母BY4742對(duì)環(huán)乙酰亞胺的敏感性，而這種敏感性可通過(guò)外源添加麥角甾醇得到修復(fù)［11］。金針菇（Flammulina velutipes）ATCC 13547的C-5甾醇去飽和酶導(dǎo)入裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）BJ7468后，通過(guò)增大細(xì)胞膜中麥角甾醇和油酸的含量（約1.5倍）增強(qiáng)了菌株對(duì)高溫、乙醇和低pH的耐受性［12］。

1.3 膜蛋白

大腸桿菌中的Mla轉(zhuǎn)運(yùn)途徑通過(guò)從外膜小葉中移除磷脂來(lái)維持細(xì)胞膜的不對(duì)稱性，進(jìn)而維持細(xì)胞膜的完整性。MlaD是Mla途徑的周質(zhì)組成部分，擁有一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲（Mammalian cell entry，MCE）結(jié)構(gòu)域。通過(guò)生物信息學(xué)分析，研究者在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了另外兩個(gè)具有MCE結(jié)構(gòu)的操縱子PqiABC和YebST。MlaD單獨(dú)敲除導(dǎo)致菌株對(duì)SDSEDTA表現(xiàn)出敏感性，而在Δmla上同時(shí)敲除上述兩個(gè)操縱子才能使得菌株對(duì)SDS-EDTA變得敏感。這種敏感性通過(guò)PqiBC的回補(bǔ)能恢復(fù)，而YebT由于毒性，其回補(bǔ)并不能獲得相同的效果。因此，PqiABC和YebST具有和Mla轉(zhuǎn)運(yùn)途徑類似的功能，對(duì)于維持細(xì)胞膜完整性具有重要作用［13］。通過(guò)比較大腸桿菌耐受菌株和野生型菌株在丁醇脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，野生型菌株中yibT和yghW（影響細(xì)胞膜脂肪酸合成）和ybjC（假定內(nèi)膜蛋白）的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，這3個(gè)基因的敲除均能增強(qiáng)了菌株的丁醇耐受性［14］。

外膜蛋白OmpF作為三聚體存在于細(xì)胞外膜中，調(diào)控糖、離子、抗生素和蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。FadL是一個(gè)外膜長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要負(fù)責(zé)外源疏水性長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入胞內(nèi)，尤其是棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1），但不能和短鏈脂肪酸（

2 外排泵

外排泵是一類通過(guò)質(zhì)子動(dòng)力將有毒分子排到胞外的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。革蘭氏陰性菌中的外排泵通常由3個(gè)蛋白組成：負(fù)責(zé)底物識(shí)別和質(zhì)子交換的內(nèi)膜蛋白、外膜通道蛋白、用于連接內(nèi)膜和外膜并維持其穩(wěn)定性的周質(zhì)融合蛋白。目前，報(bào)道較多的外排泵主要包括惡臭假單胞菌（Pseudomonas Putida）的TtgABC、TtgDEF、TtgGHI和SrpABC和大腸桿菌的AcrAB-TolC。它們都屬于耐藥結(jié)節(jié)分化（Resistance-Nodulation-Division，RND）家族的疏水/兩親的外排泵（Hydrophobe/amphiphile efflux，HAE1），能夠?qū)⒂袡C(jī)溶劑或者親脂化合物排除胞外。但不同外排泵的底物特異性明顯不同，如AcrB的底物識(shí)別范圍較廣（包括洗滌劑、抗生素和有機(jī)溶劑），而TtgB的底物特異性較高。表2匯總了近年來(lái)外排泵在改善微生物脅迫耐受性及其生產(chǎn)性能方面的研究進(jìn)展。

2011年，Dunlop等［17］從已測(cè)序的細(xì)菌基因組中挖掘所有HAE1泵的信息，利用生物信息學(xué)技術(shù)通過(guò)對(duì)比TtgB的底物識(shí)別區(qū)域篩選出43個(gè)潛在的外排泵基因，將它們分別導(dǎo)入大腸桿菌DH1的AcrAB敲除菌株后，分析工程菌株在不同脅迫下的生長(zhǎng)性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)菌株耐受性的優(yōu)良外排泵來(lái)源于完全不相干的細(xì)菌，且效果完全不同。耐受性增強(qiáng)的菌株表現(xiàn)出更好的生產(chǎn)能力，如泊庫(kù)島食烷菌中YP_692684的表達(dá)增強(qiáng)了大腸桿菌的檸檬烯耐受性（約8%），進(jìn)而提高了檸檬烯的產(chǎn)量（約60%）。惡臭假單胞菌P8（ATCC 45491）的SrpABC中SrpB發(fā)揮著最主要的作用，其在大腸桿菌K12 MG1655單獨(dú)表達(dá)后改善菌株正丁醇耐受性的效果與三基因共同表達(dá)類似，這可能是因?yàn)镾rpB是一個(gè)跨膜蛋白，它的過(guò)表達(dá)能夠幫助穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而提高菌株的耐受性［4］。

研究者通過(guò)對(duì)釀酒酵母BY4741在不同鏈烷烴脅迫（如壬烷（C9）、癸烷（C10）和十一烷（C11）和十二烷（C12））下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和過(guò)表達(dá)菌株的耐受性能分析，發(fā)現(xiàn)外排泵Snq2p和Pdr5p通過(guò)降低胞內(nèi)的烷烴濃度增強(qiáng)了菌株對(duì)C10和C11的脅迫耐受性。與革蘭氏陰性菌中的RND外排泵利用質(zhì)子或鈉離子梯度作為能量不同，外排泵Snq2p和Pdr5p屬于酵母多效性耐藥蛋白亞家族（Pleiotropic drug resistance（PDR）protein subfamily） 的 ATP偶聯(lián)盒超家族外排泵（ATP-binding cassette，ABC），主要利用ATP作為能量。盡管組學(xué)數(shù)據(jù)表明4個(gè)外排泵基因（YOR1、SNQ2、PDR5和PDR15）的表達(dá)水平在C9和C10脅迫條件下被誘導(dǎo)，但它們的過(guò)表達(dá)并不能提高菌株對(duì)C9的耐受性。YOR1和PDR15的表達(dá)均不能提高菌株對(duì)C10和C11的耐受性。這可能是因?yàn)椴煌耐馀疟帽憩F(xiàn)出不同的底物結(jié)合效率，也暗示著在烷烴脅迫下，釀酒酵母中的其他的適應(yīng)行為（如一般壓力響應(yīng)、細(xì)胞膜的調(diào)整）發(fā)揮著更為重要的作用［18］。采取類似的研究思路，F(xiàn)oo等［19］發(fā)現(xiàn)MdlB（假定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的耐多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基）是提高大腸桿菌異戊烯醇耐受性的抗逆元件。耐受性能更強(qiáng)的MdlB過(guò)表達(dá)菌株合成異戊烯醇的產(chǎn)量提高了12%，但對(duì)其他醇類物質(zhì)（如乙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇）的耐受性沒(méi)有明顯改善。

2015年，研究者發(fā)現(xiàn)大腸桿菌外排泵AcrAB敲除菌株中的基因回補(bǔ)后能提高菌株對(duì)多個(gè)α-烯烴（如苯乙烯、1-己烯、1-辛烯、1-壬烯）的耐受能力，進(jìn)而提高菌株生產(chǎn)α-烯烴（如苯乙烯）的能力。AcrAB和AcrAB-TolC的過(guò)表達(dá)能提高野生型大腸桿菌的1-己烯耐受性，但TolC的單獨(dú)過(guò)表達(dá)則沒(méi)有效果。對(duì)負(fù)責(zé)底物結(jié)合的內(nèi)膜蛋白AcrB進(jìn)行隨機(jī)突變后發(fā)現(xiàn)，6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變?cè)鰪?qiáng)了菌株的1-己烯耐受性，且突變位點(diǎn)之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。AcrB突變體的表達(dá)能略微提高菌株的膽鹽耐受性，但其對(duì)苯乙烯耐受能力沒(méi)有明顯影響［20］。類似的，通過(guò)定向進(jìn)化和脅迫條件下的篩選，研究者獲得了能提高大腸桿菌正辛烷和α-蒎烯耐受性［21］或者正丁醇、異丁醇和其他直鏈醇（直到正庚醇）耐受性［22］的AcrB優(yōu)良突變體。其中，F(xiàn)oo和Leong認(rèn)為突變體拓寬了底物進(jìn)入通道，改變了底物外排動(dòng)力學(xué)特性，促進(jìn)了AcrB與外膜通道蛋白TolC的組裝，進(jìn)而增強(qiáng)了菌株耐受性［21］。Fisher等［22］發(fā)現(xiàn)，AcrB優(yōu)良突變體能提高野生型大腸桿菌MG1655的正丁醇耐受性，但不能提高大腸桿菌MG1655ΔacrB的耐受性，這可能是因?yàn)橐吧虯crB的缺失導(dǎo)致AcrB突變體同型三聚體無(wú)法形成，從而無(wú)法發(fā)揮外排泵的正常功能。

表2 外排泵改善宿主生物耐受性和生產(chǎn)性能的小結(jié)

2016年，Boyarskiy等［23］利用大腸桿菌中能夠負(fù)向響應(yīng)外排泵AcrB表達(dá)水平的內(nèi)源啟動(dòng)子（葡萄糖酸激酶的野生型啟動(dòng)子PgntK）組成的負(fù)向反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)良外排泵突變體AcrBv2的表達(dá)水平的自動(dòng)優(yōu)化，通過(guò)減少外排泵過(guò)量表達(dá)對(duì)菌體的毒害作用，提高了大腸桿菌BW25113的丁醇耐受性（約40%）和丁醇產(chǎn)量（約35%）。

3 熱激蛋白

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）主要負(fù)責(zé)蛋白的初期折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、寡聚蛋白結(jié)構(gòu)的組合或分解、促進(jìn)不穩(wěn)定蛋白的降解以阻止其聚集等。當(dāng)細(xì)胞面臨脅迫條件時(shí)，大量熱激蛋白被誘導(dǎo)產(chǎn)生或者表達(dá)水平明顯上調(diào)，從而阻止蛋白聚集，并協(xié)助受損蛋白的重新折疊。表3匯總了近年來(lái)熱激蛋白在影響微生物脅迫耐受性及其生產(chǎn)性能方面的研究進(jìn)展。

3.1 GroESL

熱激蛋白GroESL由GroEL（單體為60 kD）和輔因子GroES（10 kD左右）組成。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中GroEL-GroES參與到約300個(gè)蛋白的折疊和再折疊，其中，GroEL能和約250個(gè)不同的蛋白相互作用，包括13個(gè)必需蛋白［24］，而GroEL缺陷的大腸桿菌中30%左右的蛋白會(huì)被錯(cuò)誤折疊［25］。

Suo等［26-27］先后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源的GroESL的過(guò)表達(dá)能分別提高酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）ATCC 25755 的丁酸耐受性［26］和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）ATCC 25755對(duì)木質(zhì)素水解產(chǎn)生的各種抑制物的耐受性，包括酚類化合物（如阿魏酸、p-香豆酸、香草醛）、呋喃類衍生物（如糠醛和5-羥甲基糠醛）和弱酸（如甲酸和乙酰丙酸）。利用游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，過(guò)表達(dá)GroESL的酪丁酸梭菌的丁酸產(chǎn)量比野生型菌株分別提高了28.2%和15.2%。過(guò)表達(dá)GroESL的拜氏梭菌能夠在分別利用玉米秸稈和稻草秸稈水解液作為底物的發(fā)酵體系中保持活力，其丁酸產(chǎn)量比野生型菌株分別提高了26.5%和19.4%。此外，GroESL在大腸桿菌BL21中的過(guò)表達(dá)提高了菌株對(duì)產(chǎn)物藤黃酚的耐受性，且存在一個(gè)最適表達(dá)水平。耐受性能增強(qiáng)的菌株能獲得更高的藤黃酚產(chǎn)量。這可能是因?yàn)镚roESL的表達(dá)能調(diào)控σ32（該因子能控制熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，負(fù)責(zé)大腸桿菌對(duì)各種脅迫條件產(chǎn)生響應(yīng)）的合成和活性［28］。

2015年，研究者將丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC 824中的groES和groEL導(dǎo)入拜氏梭菌NCIMB 8052后發(fā)現(xiàn)，重組菌株對(duì)阿魏酸的耐受性明顯增強(qiáng)，其在阿魏酸脅迫條件下的丁醇產(chǎn)量比野生型菌株提高了15%［29］。與內(nèi)源的或者來(lái)源于普通微生物的GroESL相比，來(lái)源于極端微生物的元件因?yàn)樵趪?yán)苛環(huán)境下經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)時(shí)間的馴化和進(jìn)化而表現(xiàn)出更好的效果。如來(lái)源于極端耐輻射微生物-烏魯木齊奇異球菌（Deinococcus wulumuqiensis）R12的GroESL在改善丙酮丁醇梭菌ATCC 824的各種脅迫耐受性上的效果要比內(nèi)源GroESL更為顯著。糠醛脅迫條件下，表達(dá)極端微生物來(lái)源的GroESL菌株的丁醇產(chǎn)量最高（9.5 g/L），其次是表達(dá)內(nèi)源的GroESL菌株（8.8 g/L），二者比對(duì)照菌株分別提高了35.7%和25.7%［30］。但研究者也發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的熱激蛋白在不同宿主表達(dá)時(shí)具有不同的效果。如對(duì)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，內(nèi)源groESL的過(guò)表達(dá)提高了菌株的乙醇耐受性，但卻不能增強(qiáng)高溫耐受性；導(dǎo)入溶劑耐受菌-惡臭假單胞菌的groESL能明顯增強(qiáng)菌株在47.5℃（OD600提高約69%）和5%乙醇（OD600提高約64%）脅迫下的生長(zhǎng)性能；導(dǎo)入騰沖嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）MB4的groESL則降低了菌株的生長(zhǎng)性能和脅迫耐受性。對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌丙酮丁醇梭菌，內(nèi)源groESL的過(guò)表達(dá)只是略微促進(jìn)了丁醇的合成，但并不能減輕玉米芯水解液對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用；導(dǎo)入騰沖嗜熱厭氧桿菌的groESL顯著提高菌株在玉米芯水解液脅迫條件下的生長(zhǎng)性能（OD600提高約4倍），進(jìn)而合成更多的丁醇；導(dǎo)入在惡臭假單胞菌的groESL則對(duì)丙酮丁醇梭菌在玉米水解液下的菌體生長(zhǎng)和丁醇生產(chǎn)無(wú)明顯影響。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌（丙酮丁醇梭菌、騰沖嗜熱厭氧桿菌）和陰性菌（惡臭假單胞菌、大腸桿菌）的分子機(jī)制和生理背景之間存在不同的匹配方式［31］。

3.2 DnaK

大腸桿菌里的DnaK由一個(gè)高保守的N-端ATPase域（44-45 kD）和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域組成，結(jié)構(gòu)域中的孔道結(jié)構(gòu)為蛋白折疊提供場(chǎng)所。DnaK需要與輔分子伴侶DnaJ（Hsp40的同系物）和GrpE（核苷酸交換因子）共同作用完成DnaK的循環(huán)，因此，三者形成的復(fù)合物DnaK-DnaJ-GrpE能幫助正常生長(zhǎng)條件下蛋白的初期折疊，且在損傷蛋白的重新折疊中發(fā)揮著重要作用［32］。

表3 熱激蛋白影響宿主生物耐受性和生產(chǎn)性能的小結(jié)

2019年，Vandani等［33］從嗜堿芽孢桿菌（Bacillus halodurans）Guj1中克隆得到dnaK并預(yù)測(cè)了其三維結(jié)構(gòu)，DnaK的導(dǎo)入顯著提高大腸桿菌對(duì)鹽和堿的耐受性。內(nèi)源和來(lái)自于大腸桿菌JM109的DnaK分別在乳酸乳球菌NZ9000中進(jìn)行表達(dá)后，均能顯著提高菌株的耐高溫性能。盡管大腸桿菌DnaK在乳酸乳球菌中的表達(dá)量較低且并不能影響乳酸乳球菌中內(nèi)源DnaK蛋白的表達(dá)量，但它在改善菌株高溫耐受性上的效果更明顯，并能同時(shí)提高菌株對(duì)多種非生物壓力的耐受性。高溫（40℃）下，對(duì)照菌株幾乎不能生長(zhǎng)和產(chǎn)生乳酸，但表達(dá)大腸桿菌DnaK的重組菌株仍能表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能，乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率達(dá)到了對(duì)照菌株30℃下的水平［34］。

極端耐輻射微生物-烏魯木齊奇異球菌R12中DnaK在丙酮丁醇梭菌ATCC 824的表達(dá)增強(qiáng)了菌株對(duì)丁醇、糠醛、氧化壓力和酸的耐受性?？啡┟{迫條件下，DnaK表達(dá)菌株的丁醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了52.8%。值得注意的是，內(nèi)源的DnaK在丙酮丁醇梭菌的過(guò)表達(dá)反而使菌株失去了生長(zhǎng)活力［30］。類似的，來(lái)源于熱泉的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）B3［35］和嗜酸和嗜熱極端微生物-酸熱環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）DSM 3922T［36］中的DnaK的表達(dá)均顯著增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)酸或高溫的耐受性。惡臭假單胞菌KT2442-R2中DnaK的點(diǎn)突變（445位精氨酸突變?yōu)楦彼幔┩ㄟ^(guò)提高內(nèi)源σ32和其他熱激蛋白的表達(dá)增強(qiáng)了菌株對(duì)甲苯的耐受性［37］。但也有報(bào)道認(rèn)為，單獨(dú)表達(dá)中鏈球菌（Streptococcus intermedius）NCDO2227的DnaK并不能完全回補(bǔ)大腸桿菌內(nèi)源DnaK敲除引起的熱敏感性，只有導(dǎo)入完整的DnaK系統(tǒng)（DnaK-DnaJ-GrpE）才能使菌株的耐受性完全恢復(fù)［38］。類似地，研究者發(fā)現(xiàn)來(lái)源于嗜熱微生物-熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（Parageobacillus thermoglucosidasius）DSM 2542的DnaK-DnaJ-GrpE復(fù)合物能顯著改善核黃素生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）446的高溫和滲透壓（10% NaCl）耐受性，進(jìn)而提高菌株的核黃素產(chǎn)量［39］。

3.3 其他熱激蛋白

小分子熱激蛋白是存在于所有生物體的超級(jí)家族，其結(jié)構(gòu)要比其他的熱激蛋白更具有多樣性。小分子熱激蛋白是不依賴于ATP的分子伴侶，能夠阻止非天然蛋白的聚集，幫助部分折疊已變性的蛋白，阻止由于脅迫條件造成的不可逆的蛋白聚集。

小分子熱激蛋白Hsp20（BL0576）在長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705的過(guò)表達(dá)提高了菌株的耐鹽和耐高溫性能，進(jìn)而增強(qiáng)了菌株在高溫和鹽脅迫下的產(chǎn)酸性能。此外，該小分子熱激蛋白的過(guò)表達(dá)還能提高長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)膽鹽、低pH和低溫（4℃）的耐受性［40］。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中一個(gè)分子量17 kD的小分子熱激蛋白（CeHSP17）導(dǎo)入大腸桿菌后菌株能在50℃下生長(zhǎng)，這主要是因?yàn)樵摕峒さ鞍啄芫S持高溫下細(xì)胞外膜的穩(wěn)定性，從而保護(hù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白［41］。類似的小分子熱激蛋白還有集胞藻屬（Synechocystis）的 Hsp17［42］和結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的 Hsp16.3［43］。

2019年，研究者發(fā)現(xiàn)來(lái)源于嗜熱微生物-熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（Parageobacillus thermoglucosidasius）DSM 2542的兩個(gè)熱激蛋白Hsp20-3、Hsp20-2能顯著改善核黃素生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌446的高溫和滲透壓（10% NaCl）耐受性。39℃和43℃下，兩個(gè)工程菌株的核黃素產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了23%-66%且發(fā)酵周期進(jìn)一步縮短。這一結(jié)果與工程菌株在對(duì)應(yīng)溫度下表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活力是相符的［39］。熱激蛋白 IbpA在大腸桿菌DH1（ATCC 33849）的過(guò)表達(dá)提高了菌株的異戊烯醇耐受能力，進(jìn)而提高了菌株的異戊烯醇產(chǎn)量（約16%）［19］。嗜熱微生物-騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4中的3個(gè)熱激蛋白TTE2469（編碼泛素）、GroS2（屬于Hsp10家族）和IbpA（屬于Hsp20家族）能夠提高釀酒酵母INVSc1的高溫耐受性，使得菌株的發(fā)酵溫度范圍拓展到28-35℃，發(fā)酵周期縮短為72 h，β-香樹脂醇的產(chǎn)量提高約28%。這些熱激蛋白的調(diào)控機(jī)制主要涉及細(xì)胞壁完整性的維持、海藻糖的積累和能量產(chǎn)生途徑的激活［44］。酪丁酸梭菌ATCC 25755的多個(gè)熱激蛋白（grpE，dnaJ，htpG）的表達(dá)水平在丁酸脅迫后均顯著上調(diào)，且表達(dá)水平與丁酸濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)性。分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)菌株后發(fā)現(xiàn)，htpG的過(guò)表達(dá)能提高菌株的丁酸耐受性，grpE沒(méi)有效果，而dnaJ的過(guò)表達(dá)呈負(fù)向作用［26］。

4 DNA修復(fù)相關(guān)基因

微生物在面臨外界脅迫時(shí)胞內(nèi)的DNA會(huì)受到不同程度的損傷，如雙鏈結(jié)構(gòu)的斷裂和破壞、堿基或堿基對(duì)被切除或替換等，由此引發(fā)細(xì)胞周期延遲或阻滯甚至細(xì)胞死亡等。因此，DNA修復(fù)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫條件的重要生理過(guò)程。天津科技大學(xué)駱健美課題組通過(guò)分析簡(jiǎn)單節(jié)桿菌CGMCC14539在亞致死乙醇濃度下的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和過(guò)表達(dá)菌株的耐受性能，確定了DNA重組/修復(fù)蛋白R(shí)ecA和DNA解旋酶UvrD是增強(qiáng)菌株有機(jī)溶劑耐受性的抗逆元件［45］。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecO在乳酸乳球菌NZ9000中的異源表達(dá)顯著提高了菌株對(duì)酸、鹽和氧化脅迫的耐受性，但卻不能增強(qiáng)菌株對(duì)乙醇和高溫脅迫的耐受性。3%NaCl脅迫下，具有更強(qiáng)耐鹽性能的RecO表達(dá)菌株表現(xiàn)出更好的乳酸發(fā)酵性能［46］。

5 氧化應(yīng)激相關(guān)基因

正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體中的各種抗氧化防御機(jī)制可以使得胞內(nèi)氧化還原水平維持在一定的動(dòng)態(tài)平衡。而受到脅迫條件時(shí)，這種平衡被打破從而使細(xì)胞向氧化損傷破壞的方向發(fā)展，這種現(xiàn)象被稱為氧化應(yīng)激。目前，生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)主要包括抗氧化酶系統(tǒng)（如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶等）、小分子抗氧化劑（如半胱氨酸、谷胱甘肽、維生素C等）。

大腸桿菌氧化應(yīng)激響應(yīng)中參與損傷修復(fù)的鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶Fpr的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了大腸桿菌DH1（ATCC 33849）的異戊烯醇耐受性，進(jìn)而提高了菌株的異戊烯醇產(chǎn)量［20］。天津科技大學(xué)駱健美課題組通過(guò)超氧化物歧化酶SOD和過(guò)氧化氫酶KatG的過(guò)表達(dá)，提高了簡(jiǎn)單節(jié)桿菌（Arthrobacter simplex）CGMCC14539的有機(jī)溶劑的耐受性［45］。釀酒酵母BY4741中的線粒體過(guò)氧化氫酶編碼基因cta1、胞質(zhì)過(guò)氧化氫酶編碼基因ctt1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶編碼基因gsh1、谷胱甘肽合成酶編碼基因gsh2以及谷胱甘肽還原酶編碼基因glr1的過(guò)表達(dá)對(duì)菌株脅迫耐受性的影響表現(xiàn)出明顯的基因特異性和脅迫特異性。其中，cta1提高菌株5-羥甲基糠醛（HMF）耐受性的效果優(yōu)于ctt1，但二者提高菌株糠醛耐受性的效果類似；glr1的過(guò)表達(dá)略微提高了菌株對(duì)HMF的耐受性但顯著提高了菌株對(duì)糠醛的耐受性；gsh1的過(guò)表達(dá)對(duì)菌株的HMF耐受性無(wú)明顯影響但卻顯著提高了菌株的糠醛耐受性；gsh2的過(guò)表達(dá)對(duì)菌株的HMF和糠醛耐受性均無(wú)明顯影響。此外，氧化壓力調(diào)節(jié)蛋白Yap1的突變也能提高菌株的糠醛和 HMF 耐受性［47］。

研究者通過(guò)比較檸檬烯耐性突變株FM003和大腸桿菌BW25113的全基因組序列發(fā)現(xiàn)，耐性突變株的烷基氫過(guò)氧化物酶AhpC上發(fā)生了一處點(diǎn)突變（L177Q）。敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明，AhpCL177Q突變體能增強(qiáng)菌株對(duì)檸檬烯及其氧化物（主要是檸檬烯氫過(guò)氧化物）的耐受性［48］。來(lái)源于乳酸乳球菌的NADH氧化酶編碼基因noxE在釀酒酵母BY4741中的表達(dá)提高了菌株的耐鹽能力。與對(duì)照菌株相比，工程菌株在有氧發(fā)酵條件下表現(xiàn)出更少的甘油合成、更快的葡萄糖消耗和菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而合成更多的乙醇。NADH氧化酶的過(guò)表達(dá)降低了胞內(nèi)的ROS水平（約10%），改變了胞內(nèi)乙醇和甘油代謝、硫胺素合成、細(xì)胞死亡等多個(gè)途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并通過(guò)上調(diào)全局轉(zhuǎn)錄因子HAP4的表達(dá)水平影響了其他途徑（如氧化磷酸化、鋅代謝、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，但卻并沒(méi)有激活高滲透壓甘油途徑。綜上所述，NADH氧化酶的過(guò)表達(dá)改變了菌株發(fā)酵過(guò)程的胞內(nèi)代謝，從而增強(qiáng)了其脅迫耐受性［49］。

6 相容性溶質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因

相容性溶質(zhì)是一類高度水溶性、不帶靜電荷、沒(méi)有活性基團(tuán)，不影響重要細(xì)胞活動(dòng)和代謝的有機(jī)小分子，其在胞內(nèi)的大量積累不會(huì)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的功能，且能夠維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡。因此，胞內(nèi)相容性溶質(zhì)的變化是微生物應(yīng)對(duì)脅迫條件的重要適應(yīng)行為。表4匯總了近年來(lái)相容性溶質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因在影響微生物脅迫耐受性及其生產(chǎn)性能方面的研究進(jìn)展。

海藻糖是一類廣泛存在于真菌、細(xì)菌、昆蟲和植物中的非還原性糖，由兩分子葡萄糖基組成（α-D-吡喃葡糖-1-1α-D-葡萄糖苷）。細(xì)菌中常見(jiàn)的海藻糖合成途徑有3條，第一條為TPS/TPP途徑，otsA編碼的6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）催化葡萄糖生成6-磷酸海藻糖，再通過(guò)otsB編碼的6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）去磷酸化生成海藻糖，該途徑最早被發(fā)現(xiàn)也存在最為廣泛。第二條為TS途徑，該途徑由海藻糖合成酶（TreS）催化，將麥芽糖異構(gòu)化為海藻糖。第三條為 TreY/TreZ途徑，麥芽糖糊精首先通過(guò)麥芽寡糖基海藻糖合成酶（TreY）轉(zhuǎn)糖基化為麥芽寡糖基海藻糖，之后被麥芽寡糖基海藻糖水解酶（TreZ）水解釋放出海藻糖。

表4 相容性溶質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因影響宿主生物耐受性和生產(chǎn)性能的小結(jié)

天津科技大學(xué)駱健美課題組系統(tǒng)分析了簡(jiǎn)單節(jié)桿菌CPCC 140451在乙醇脅迫下的胞內(nèi)海藻糖、甘油、脯氨酸、谷氨酸4種相容性溶質(zhì)的含量變化情況。亞致死濃度下，隨著乙醇濃度的增大，海藻糖和甘油的含量增加而脯氨酸和谷氨酸的含量減少。海藻糖合成基因otsA、otsB和treS的過(guò)表達(dá)均能提高簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的乙醇和甲醇耐受性，其中，otsB的效果優(yōu)于treS和otsA，這一結(jié)果與菌株的胞內(nèi)海藻糖含量是一致的。乙醇耐受性能更強(qiáng)的工程菌株在高濃度底物和乙醇的轉(zhuǎn)化體系中表現(xiàn)出更好的細(xì)胞活力，這使得其生產(chǎn)性能明顯改善。此外，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中這3個(gè)海藻糖合成相關(guān)基因的表達(dá)也能提高大腸桿菌的多種脅迫耐受性。海藻糖的保護(hù)機(jī)制與維持更好的細(xì)胞完整性和細(xì)胞穩(wěn)定性、更強(qiáng)的活性氧簇清除能力和更高的能量水平密切相關(guān)［50］。大腸桿菌otsBA操縱子的過(guò)表達(dá)不僅改善了菌株在含有精制甘油的合成培養(yǎng)基時(shí)的發(fā)酵性能，而且提高了菌株直接利用粗甘油發(fā)酵得到的產(chǎn)物水平。這種發(fā)酵性能的改善與菌株對(duì)疏水性產(chǎn)物β-胡蘿卜素、底物粗甘油中單一雜質(zhì)粗脂肪酸、過(guò)氧化叔丁醇以及粗甘油混合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性密切相關(guān)［51］。嗜酸丙酸桿菌（Propionibacterium acidipropionici）CGMCC 1.2232的基因組測(cè)序結(jié)果表明，該菌株含有兩個(gè)假定的海藻糖合成途徑OtsA-OtsB和TreY-TreZ。通過(guò)敲除菌株構(gòu)建和海藻糖含量分析，研究者發(fā)現(xiàn)在嗜酸丙酸桿菌的海藻糖合成途徑中OtsA比TreY發(fā)揮著更為重要作用。與野生型菌株相比，海藻糖含量提高的otsA過(guò)表達(dá)菌株的丙酸耐受性最高，丙酸轉(zhuǎn)化率提高了11%［52］。研究者在乳酸乳球菌NZ9000中分別共表達(dá)乳酸乳球菌內(nèi)源基因TrePP、β-pgm和來(lái)自費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）的海藻糖磷酸酯酶otsB三個(gè)基因，以及大腸桿菌的otsBA操縱子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NZ9000（pNZtpo）菌株和NZ9000（pNZotsBA）在pH 3脅迫下的存活率相當(dāng)，均高于對(duì)照菌株。在低溫（4℃）和高溫（45℃）的條件下，菌株存活率按從高至低的順序均為NZ9000（pNZotsBA）>NZ9000（pNZtpo）>對(duì)照菌株。這種耐受性的增強(qiáng)與其他的一般壓力響應(yīng)無(wú)關(guān)（如熱激蛋白和DNA損失），而是直接與海藻糖的存在有關(guān)，但海藻糖含量增加的工程菌株并沒(méi)有對(duì)冷凍和干燥表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性［53］。

酵母中尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）依賴的海藻糖合成途徑（系統(tǒng)I）主要包含tps1編碼的6-磷酸海藻糖合成酶TPS、tps2編碼的6-磷酸海藻糖酯酶TPP，對(duì)TPS1和TPS2具有調(diào)控作用的TPS3，以及tsl1編碼的海藻糖合成蛋白復(fù)合體TSL1。海藻糖的水解主要受到nth1和nth2基因編碼的中性水解酶和ath1基因編碼的酸性水解酶的調(diào)控。

tps1在釀酒酵母10151中的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了菌株的耐高溫性，進(jìn)而提高了菌株在38℃下的發(fā)酵性能。過(guò)表達(dá)菌株發(fā)酵24 h時(shí)的乙醇產(chǎn)量與其在30℃下的水平相當(dāng)，而對(duì)照菌株的乙醇產(chǎn)量急劇下降，僅為過(guò)表達(dá)菌株的45%［54］。ATH1在釀酒酵母TCY1中表達(dá)活性的下降增強(qiáng)了菌株的乙醇耐受性，縮短了發(fā)酵周期，提高了乙醇的生產(chǎn)速率［55］。

與單個(gè)基因的操作相比，多基因的組合操作在調(diào)控海藻糖含量上表現(xiàn)出更明顯的優(yōu)勢(shì)。2016年，研究者在釀酒酵母BCRC 21685（SC）中構(gòu)建tps1過(guò)表達(dá)菌株SCT和tps1過(guò)表達(dá)nth1敲除菌株SCTΔN。無(wú)/有乙醇脅迫的條件下，SCTΔN菌株的海藻糖含量最高。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度超過(guò)15%時(shí)，SCTΔN菌株表現(xiàn)出最好的發(fā)酵性能，這與該菌株具有最強(qiáng)的乙醇和葡萄糖耐受性相關(guān)［56］。分別在釀酒酵母ZS中構(gòu)建tps1基因過(guò)表達(dá)菌株ZSptps1，ath1缺失菌株ZSΔath1和tps1基因過(guò)表達(dá)ath1缺失突變株ZSpTΔA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖含量為270 g/L的濃醪發(fā)酵過(guò)程中，盡管所有菌株的發(fā)酵速率都有所降低，但3株工程菌株的發(fā)酵性能（發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和葡萄糖消耗速率）均明顯高于野生型菌株。這種發(fā)酵性能的改善與工程菌株對(duì)高滲和乙醇具有更強(qiáng)的耐受性密切相關(guān)，而菌株的耐受性與其胞內(nèi)海藻糖含量是一致的［57］。研究者在釀酒酵母FY834分別構(gòu)建了nth1，nth2，ath1三基因敲除菌株nth1Δnth2Δath1、tps1過(guò)表達(dá)的三基因敲除菌株和tps2過(guò)表達(dá)的三基因敲除菌株。在乙醇、高溫和冷凍的脅迫條件下，積累更高海藻糖含量的工程菌株的比生長(zhǎng)速率均高于野生型菌株，其中，tps1過(guò)表達(dá)的三基因敲除菌株的耐受性最強(qiáng)。但海藻糖的積累并不能提高菌株對(duì)氧化脅迫的耐受性［58］。

依賴腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）的海藻糖合成途徑（系統(tǒng)II）是面包酵母中海藻糖積累的第二條重要途徑，主要與麥芽糖利用有關(guān)。酵母中的麥芽糖代謝受到麥芽糖滲透酶、麥芽糖酶和調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)，其中，麥芽糖酶比麥芽糖滲透酶發(fā)揮著更為重要的作用。研究者將麥芽糖酶編碼基因maL62和6-磷酸海藻糖合成酶基因tps1分別導(dǎo)入面包酵母BY14（B）和它的nth1敲除菌株（B-N）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同遺傳背景的菌株，maL62的單獨(dú)過(guò)表達(dá)可通過(guò)增加tps1的活力提高胞內(nèi)的海藻糖含量，但其效果不如tps1的單獨(dú)過(guò)表達(dá)。在預(yù)發(fā)酵冷凍和長(zhǎng)期冷凍的兩種脅迫條件下，maL62的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞耐受性的效果與tps1過(guò)表達(dá)類似，這說(shuō)明maL62過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞冷凍耐受性的提高不僅僅與海藻糖合成有關(guān)，還可能涉及到其他途徑（如熱激蛋白Hsp90）。所有的工程菌株中，同時(shí)過(guò)表達(dá)maL62和tps1且敲除nth1的菌株（B-N+T+M）具有最強(qiáng)的冷凍耐受性，這與其含有最高的海藻糖含量密切相關(guān)。凍融脅迫下，maL62的過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵性能顯著提高，冷凍耐受性最好的菌株（B-N+T+M）的發(fā)酵性能最好［59］。

L-脯氨酸是一種亞氨基酸，其可以在高滲調(diào)節(jié)劑下防止蛋白質(zhì)和細(xì)胞物質(zhì)變性。研究者發(fā)現(xiàn)，L-脯氨酸合成過(guò)程關(guān)鍵酶γ-谷?；っ竿蛔凅wpro1D154N通過(guò)提高L-脯氨酸合成過(guò)程中催化前兩步反應(yīng)的γ-谷?；っ负挺?谷?；姿徇€原酶的活性，促進(jìn)胞內(nèi)脯氨酸的積累，脯氨酸濃度更高的突變菌株增強(qiáng)了釀酒酵母的乙醇耐受性。在清酒酵母菌株XUW-TRP的基礎(chǔ)上，敲除了利用L-脯氨酸的PUT1基因并將野生型PRO1等位替換為pro1D154N后，重組菌株（XUDput1-MT）的L-脯氨酸含量和乙醇耐受性進(jìn)一步增強(qiáng)，但二者的乙醇發(fā)酵性能無(wú)明顯差異。作者認(rèn)為這可能是因?yàn)橐掖寄褪苄匀Q于菌株的培養(yǎng)條件和壓力響應(yīng)，而且菌株在實(shí)驗(yàn)室靜態(tài)和清酒釀造條件下的代謝情況也完全不同。此外，乙醇耐受性因菌株而異，實(shí)驗(yàn)室菌株和清酒酵母具有完全不同的遺傳背景［60］。

7 能量調(diào)控相關(guān)基因

微生物應(yīng)對(duì)脅迫條件時(shí)，胞內(nèi)的多個(gè)能量依賴過(guò)程都會(huì)參與其適應(yīng)行為，如外排泵和熱激蛋白，此外，對(duì)胞內(nèi)大分子的損傷進(jìn)行修復(fù)或者再合成的過(guò)程也需要更多能量的產(chǎn)生。表5匯總了近年來(lái)能量調(diào)控相關(guān)基因在影響微生物脅迫耐受性及其生產(chǎn)性能方面的研究進(jìn)展。

糖酵解途徑（Embden-meyerhof parnas，EMP）中的兩個(gè)關(guān)鍵酶6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的編碼基因pfkA和pykA在丙酮丁醇梭菌ATCC 824分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)和共表達(dá)。結(jié)果表明，所有工程菌株的發(fā)酵性能均明顯高于野生型菌株，其中，pfkA和pykA共表達(dá)菌株的丁醇生產(chǎn)速率和丁醇產(chǎn)量要高于兩個(gè)單獨(dú)過(guò)表達(dá)菌株，這主要是因?yàn)樵摼昃哂凶罡叩亩〈寄褪苄裕@種耐受性的增強(qiáng)與基因過(guò)表達(dá)后導(dǎo)致的胞內(nèi)ATP含量的增加密切相關(guān)［61］。通過(guò)比較大腸桿菌丁醇耐受菌株和野生型菌株在丁醇脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，乙醛酸醛連接酶編碼基因gcl和乙醇酸氧化酶的離子-硫亞基編碼基因glcF的轉(zhuǎn)錄水平急劇上調(diào)。兩個(gè)基因在大腸桿菌JM109中的過(guò)表達(dá)均能顯著提高菌株的丁醇耐受性，這可能是兩個(gè)酶通過(guò)調(diào)節(jié)乙醛酸和丙酮酸等用于補(bǔ)充TCA循環(huán)的中間代謝物的水平直接增強(qiáng)了胞內(nèi)的TCA 循環(huán)［14］。

嘌呤核苷酸是胞內(nèi)能量的主要載體，也參與到維持細(xì)胞正常功能的各種酶促反應(yīng)中。2019年，上海交通大學(xué)趙心清課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和過(guò)表達(dá)菌株的性能分析發(fā)現(xiàn)，參與嘌呤從頭合成途徑的3個(gè)基因ADE1、ADE13、ADE17在提高釀酒酵母BY4741脅迫耐受性上發(fā)揮正向調(diào)控作用，提高了菌株對(duì)纖維素水解液中各種抑制劑（如醋酸、羥甲基苯甲醛、苯酚、香草醛、丁香醛）的耐受性。其中，ADE17基因（編碼的酶同時(shí)擁有5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）轉(zhuǎn)甲?；负突饷傅幕钚裕┬Ч詈?，它的過(guò)表達(dá)還能提高菌株對(duì)高溫、高滲和丙酸的耐受性。與對(duì)照菌株相比，ADE過(guò)表達(dá)菌株在醋酸脅迫（pH 4.5）、模擬的木質(zhì)纖維素水解液和真實(shí)的玉米秸稈水解液等多個(gè)條件下表現(xiàn)更好的生長(zhǎng)性能和發(fā)酵性能，其中，耐受性能最強(qiáng)的ADE17過(guò)表達(dá)菌株的效果最好［62］。磷酸核糖焦磷酸是體內(nèi)嘌呤、嘧啶和嘧啶核苷酸從頭合成和補(bǔ)救合成的重要底物。研究者將磷酸核糖焦磷酸合成酶復(fù)合物的一個(gè)亞基PRS3在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工業(yè)菌株P(guān)E-2（NCYC 3233）中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，菌株在醋酸脅迫下利用木糖或葡萄糖為唯一碳源的生長(zhǎng)和耗糖能力顯著增強(qiáng)。這種耐受性的增加與PRS3過(guò)表達(dá)能更好的維持脅迫下的細(xì)胞完整性密切相關(guān)。與對(duì)照菌株相比，過(guò)表達(dá)菌株在利用毛泡桐（Paulownia tomentosa）各種水解產(chǎn)物（如醋酸、糠醛、羥甲基糠醛等）發(fā)酵時(shí)表現(xiàn)出更好的細(xì)胞活力、耗糖能力和乙醇生產(chǎn)能力［63］。

V-ATPase是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、具有高度保守性的質(zhì)子泵，主要利用ATP水解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞質(zhì)的H+泵入液泡使其酸化，從而維持胞內(nèi)的pHi平衡。酵母V-ATPase是由14個(gè)亞基組成的復(fù)合酶，其中，RAV2、DBF2和VMA41/CYS4/NHS5是負(fù)責(zé)酶的組裝或調(diào)控酶活的基因。研究者將這3個(gè)基因在巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）衍生菌株中分別過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，菌株在8%（V/V）乙醇脅迫下的細(xì)胞存活數(shù)均提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。乙醇耐受性的提高使得菌株在利用高糖培養(yǎng)基和濃醪麥芽汁的發(fā)酵過(guò)程中具有更高的生產(chǎn)速率，其中，DBF2的效果最為明顯。但這3個(gè)基因的過(guò)表達(dá)并不能增強(qiáng)菌株對(duì)酵母發(fā)酵過(guò)程中的另一個(gè)常見(jiàn)壓力-高滲的耐受性，說(shuō)明過(guò)表達(dá)菌株的濃醪發(fā)酵性能的改善主要與其乙醇耐受性的增強(qiáng)密切相關(guān)［64］。鉀泵TRK1和質(zhì)子泵PMA1在釀酒酵母中的過(guò)表達(dá)表現(xiàn)出不同的效果，前者提高了菌株的乙醇產(chǎn)量（約18%），后者則沒(méi)有明顯效果，但兩者同時(shí)過(guò)表達(dá)產(chǎn)生一定協(xié)同作用，菌株的乙醇產(chǎn)量提高了約27%，該發(fā)酵結(jié)果與菌株在生產(chǎn)過(guò)程中面臨脅迫條件時(shí)表現(xiàn)出的細(xì)胞活力是相符的。將這兩個(gè)基因在不同遺傳背景的菌株（商業(yè)化菌株和實(shí)驗(yàn)室菌株）中過(guò)表達(dá)后，也明顯改善了菌株對(duì)不同底物（葡萄糖或者木糖）的發(fā)酵性能。其中，K+的吸收產(chǎn)生了主要的電動(dòng)勢(shì)，H+的外排主要產(chǎn)生響應(yīng)電流。這種胞外更多鉀離子的泵入和胞內(nèi)更多H+的泵出縮小了跨膜離子濃度差，降低了脅迫下的離子泄露速率，進(jìn)而提高了菌株的乙醇耐受性［65］。

表5 能量調(diào)控相關(guān)基因影響宿主生物耐受性和生產(chǎn)性能的小結(jié)

8 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞功能起到開關(guān)調(diào)控作用。因此，在菌株應(yīng)對(duì)脅迫條件時(shí)發(fā)揮重要作用。研究者通過(guò)分析在丁醇耐受性和生產(chǎn)性能上存在明顯差異的丙酮丁醇梭菌ATCC 55025和突變株JB200的基因組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，突變株JB200的cac3319基因發(fā)生了一個(gè)堿基缺失，這使得該基因編碼的組氨酸激酶（一個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白）的C端發(fā)生嚴(yán)重截?cái)啵ㄔ虚L(zhǎng)度的75%），導(dǎo)致活性中心序列完全丟失，進(jìn)而引起酶的功能喪失。通過(guò)敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了組氨酸激酶Cac3319的失活是突變株具有更高丁醇耐受性和生產(chǎn)性能的主要原因。與野生型菌株ATCC 55025相比，具有更高丁醇耐受性的敲除菌株HKKO的丁醇產(chǎn)量和生產(chǎn)速率分別提高了44%和 90%［66］。

通過(guò)對(duì)醋酸敏感的釀酒酵母突變株的基因篩選，研究者發(fā)現(xiàn)ypk1基因突變導(dǎo)致其功能的失活是菌株醋酸敏感性增強(qiáng)的原因。Ypk1是蛋白激酶AGC家族的成員，位于細(xì)胞質(zhì)膜上的雷帕霉素靶蛋白TORC2能使其C端結(jié)構(gòu)域的特定位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致活性大幅度提高，而這種TORC2-Ypk1的激活作用受到醋酸脅迫的誘導(dǎo)。TORC2-Ypk1的信號(hào)模塊通過(guò)激活L-絲氨酸：棕櫚?；?CoA酰基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)了鞘脂的合成。通過(guò)化學(xué)方法（添加鞘脂類物質(zhì)合成的化學(xué)抑制劑）、基因方法（構(gòu)建對(duì)應(yīng)的突變菌株）和培養(yǎng)基中外源添加的方法，進(jìn)一步證明了鞘脂合成對(duì)菌株醋酸耐受性的必要性。這些結(jié)果說(shuō)明，TORC2-Ypk1通過(guò)調(diào)節(jié)鞘脂合成在釀酒酵母的醋酸耐受性中發(fā)揮正向調(diào)控作用［67］。也有報(bào)道認(rèn)為，TORC2-Ypk1和鞘脂的合成對(duì)于脅迫條件下釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平維持在可耐受的范圍是非常重要的［68］。

9 全局轉(zhuǎn)錄因子

與單個(gè)或多個(gè)功能基因、特定或局部的轉(zhuǎn)錄因子相比，位于生物體金字塔式代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)頂端的全局轉(zhuǎn)錄因子能從全基因水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在改善復(fù)雜的耐受性表型上表現(xiàn)出更大優(yōu)勢(shì)。大腸桿菌的全局轉(zhuǎn)錄因子-環(huán)腺苷酸受體蛋白（Cyclic amp receptor protein，CRP）和 RpoD（σ70）是報(bào)道較多的全局轉(zhuǎn)錄因子。近年來(lái)，其他全局轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控微生物耐受性方面也表現(xiàn)出良好效果。

9.1 Crz1p

Crz1p是能特異性結(jié)合位于大部分壓力響應(yīng)基因啟動(dòng)子上的鈣調(diào)磷酸酶-依賴響應(yīng)因子保守序列的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。Crz1p作為一個(gè)能調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)水平的全局轉(zhuǎn)錄因子，首次在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)，隨后在許多低等真核生物中也有報(bào)道。

釀酒酵母工業(yè)菌株HS13中分別過(guò)表達(dá)內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子Crzlp或者來(lái)源于戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）的結(jié)構(gòu)類似物TdCRZ1均能提高菌株的鹽和冷凍耐受性，與野生型菌株相比，耐受能力更強(qiáng)的Crzlp和TdCRZ1表達(dá)菌株利用預(yù)冷的、高糖面團(tuán)發(fā)酵時(shí)表現(xiàn)出更好的生產(chǎn)性能。此外，過(guò)表達(dá)植物中的Crzlp結(jié)構(gòu)類似物-Cys2/His2-類型的鋅指蛋白STZ和FTZ［來(lái)源于擬南芥（Arabidopsis thaliana）］也能提高釀酒酵母的耐冷凍能力［69］。通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究者驗(yàn)證了光滑假絲酵母（Candida glabrata）ATCC 2001中Crzlp對(duì)于菌株在酸性條件（pH2.0）下的生長(zhǎng)是必不可少的。在不添加pH緩沖劑的酸性發(fā)酵體系下，Crzlp過(guò)表達(dá)菌株由于耐酸性能的增強(qiáng)，其菌體干重和丙酮酸產(chǎn)量分別比野生型菌株提高了48%和60%。pH 2脅迫下，Crzlp過(guò)表達(dá)菌株中C18∶1脂肪酸的含量和麥角甾醇含量比野生型菌株分別增加了16%和40%，這種膜脂組成的變化是增強(qiáng)細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性的重要原因。此外，Crzlp的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了菌株酸性脅迫下的H+-ATPase活性，這促進(jìn)了胞內(nèi)質(zhì)子的泵出，減少了胞內(nèi)的酸化［70］。

9.2 HAA1

HAA1能直接或者間接地調(diào)控80%與醋酸響應(yīng)相關(guān)的基因，是釀酒酵母在醋酸脅迫下負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄組重構(gòu)的全局轉(zhuǎn)錄因子。研究者發(fā)現(xiàn)，HAA1的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母BY4741的醋酸脅迫耐受性，這與該基因能夠上調(diào)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，如參與鞘脂類代謝的蛋白YPC1、細(xì)胞壁相關(guān)的分泌糖蛋白YGP1、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TPO2和TPO3、負(fù)責(zé)SNF1磷酸化的蛋白激酶TOS3等。菌株耐酸性能的增強(qiáng)使得其發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的性能明顯提高，如50 mmol/L醋酸脅迫下，過(guò)表達(dá)菌株的乙醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率比對(duì)照菌株分別提高了156%和23.1%，當(dāng)醋酸濃度提高到100 mmol/L時(shí)，對(duì)照菌株已不能生成乙醇而過(guò)表達(dá)菌株的乙醇產(chǎn)量為 0.8 g/L［71］。2018 年，Cunha 等［63］利用該轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)提高了工業(yè)釀酒酵母PE-2（NCYC 3233）在醋酸脅迫下利用木糖或葡萄糖為唯一碳源的生長(zhǎng)性能及其對(duì)應(yīng)的糖耗能力。該工作將釀酒酵母能夠耐受的最大醋酸濃度由2.4 g/L增大到4 g/L［71］。這種耐受性能的改善與細(xì)胞壁完整性的增強(qiáng)密切相關(guān)。利用未經(jīng)脫毒處理的毛泡桐水解物（添加葡萄糖和木糖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，過(guò)表達(dá)菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的葡萄糖和木糖消耗能力、更高的生物量和乙醇產(chǎn)量。

9.3 其他全局轉(zhuǎn)錄因子

FadR和MarR分別是控制胞內(nèi)脂肪酸合成和多重藥物抗性的全局轉(zhuǎn)錄因子。FadR的單獨(dú)過(guò)表達(dá)提高了大腸桿菌ΔaasΔfadDBTE表達(dá)菌株的中鏈脂肪酸耐受性，進(jìn)而使得中鏈脂肪酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了約30%［7］。FadR和MarR在大腸桿菌BW25113的單敲除均增強(qiáng)了菌株對(duì)正己烷和正己烷/環(huán)己烷混合物的耐受性。其中，F(xiàn)adR的敲除促進(jìn)了飽和脂肪酸（如棕櫚酸）的合成，抑制了不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵酶（如FabA和FabB）的活性，導(dǎo)致的飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比值的增大減少了細(xì)胞膜對(duì)有機(jī)溶劑的通透性，進(jìn)而降低了有機(jī)溶劑在胞內(nèi)的積累。而MarR的敲除對(duì)胞內(nèi)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比值沒(méi)有影響，它主要通過(guò)激活全局轉(zhuǎn)錄因子MarA的表達(dá)上調(diào)了外排泵的活力，促進(jìn)了有機(jī)溶劑的泵出。此外，這2個(gè)基因的單獨(dú)敲除還改變了數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)水平。值得注意的是，共同敲除菌株的有機(jī)溶劑耐受性要明顯高于單個(gè)基因敲除菌株，這說(shuō)明二者之間存在著協(xié)同作用［72］。

研究者通過(guò)馴化的方法提高了大腸桿菌對(duì)木質(zhì)纖維素快速熱解過(guò)程中產(chǎn)生的熱解糖漿的耐受性。比較進(jìn)化菌株（TJE1）和親本菌株（KO11+lgk）的基因組序列信息后發(fā)現(xiàn)，CsrA（一個(gè)全局碳源存儲(chǔ)調(diào)節(jié)子，影響多個(gè)基因的的翻譯）的編碼基因發(fā)生了突變。將進(jìn)化菌株中的CsrA突變體替換親本菌株中的野生型CsrA后，菌株的熱解糖漿耐受性顯著提高，其主要原因是CsrA突變體通過(guò)降低胞外聚合物蛋白的合成增強(qiáng)了脅迫下的細(xì)胞膜完整性［73］。

10 其他基因

10.1 中介體（Mediator）

中介體是RNA聚合酶II通用轉(zhuǎn)錄的重要組分，主要由頭部、中部、尾部和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8（CDK8）4個(gè)模塊組成，在真核mRNA合成的活化和阻抑中發(fā)揮重要作用。江南大學(xué)劉立明課題組先后報(bào)道，中介體尾部亞基Med15B［74］和Med3［75］的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)光滑假絲酵母ATCC 2001的酸脅迫耐受性。過(guò)表達(dá)菌株中的油酸（C18∶1）含量、總的磷脂含量、麥角甾醇含量和不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比值均出現(xiàn)上調(diào)，進(jìn)而提高了菌株在酸脅迫下的細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性。此外，基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的H+-ATP酶活的提高能促進(jìn)胞內(nèi)質(zhì)子的泵出，使胞內(nèi)H+維持在較低水平。耐受性增強(qiáng)的過(guò)表達(dá)菌株在沒(méi)有pH緩沖劑的發(fā)酵體系下，細(xì)胞干重和丙酮酸產(chǎn)量比親本菌株均顯著提高。

10.2 氨基酸脫羧途徑

氨基酸脫羧反應(yīng)是細(xì)菌簡(jiǎn)單分解代謝途徑的一部分，前體氨基酸從培養(yǎng)基中被吸收，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)生脫羧反應(yīng)后再以氨基衍生物的形式分泌到培養(yǎng)基中。脫羧反應(yīng)中質(zhì)子被消耗，CO2被釋放，前體的吸收和產(chǎn)物的跨膜分泌都需要轉(zhuǎn)運(yùn)交換模式介導(dǎo)從而產(chǎn)生電子。因此，脫羧反應(yīng)和電子交換的偶聯(lián)會(huì)產(chǎn)生了一個(gè)質(zhì)子推動(dòng)力，它由跨膜的pH梯度ΔpH（胞內(nèi)堿性）和電位梯度ΔΨ（胞內(nèi)負(fù)電）組成，為細(xì)胞次級(jí)代謝提供能量。

研究者發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的谷氨酸脫羧系統(tǒng)的敲除降低了菌株在胃酸脅迫下的耐受性［76］，屎腸球菌（Enterococcus faecium）的酪氨酸脫羧系統(tǒng)［77］與菌株在pH 2.5脅迫下的耐受性相關(guān)。大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶（GadBC）導(dǎo)入惡臭假單胞菌S16后能顯著提高菌株的耐酸性能。pH 5.5條件下，重組菌株對(duì)苯甲酸或尼古丁表現(xiàn)出更好降解能力（48 h降解90%），而野生型菌株完全失去了降解能力。這可能是因?yàn)楣劝彼崦擊让傅谋磉_(dá)不僅能保證胞內(nèi)pHi的平衡，也能暫時(shí)提高胞內(nèi)γ-氨基丁酸的含量，通過(guò)跨膜電勢(shì)的翻轉(zhuǎn)抵消質(zhì)子的不正當(dāng)進(jìn)入，這一策略與極端嗜酸微生物的酸脅迫響應(yīng)非常類似［78］。

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CHCC 1524編碼組氨酸脫羧途徑的hdcAPB操縱子（包括組氨酸脫羧酶編碼基因hdcA、組氨酸/組胺交換基因hdcP、HdcA成熟因子基因hdcB）導(dǎo)入乳酸乳球菌NZ9000后，在組氨酸存在的條件下，過(guò)表達(dá)菌株能夠在pH 3的酸脅迫下存活2 h而野生型菌株則快速死亡。這種耐受性的提高與組氨酸脫羧途徑提高胞內(nèi)的pHi，阻止胞內(nèi)酶的變性密切相關(guān)。值得注意的是，組氨酸脫羧途徑和糖酵解途徑在提高菌株的耐酸性能上存在著協(xié)同效應(yīng)，二者共同作用使得菌株在pH 2.5極端條件下的存活率提高了約10倍［79］。研究者將谷氨酸脫羧酶（GAD）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的編碼基因gadB和gdh分別在詹氏丙酸梭菌（Propionibacterium jensenii）ATCC 4868過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，菌株的丙酸脅迫耐受性和發(fā)酵性能均明顯增強(qiáng)。與野生型菌株相比，gadB過(guò)表達(dá)菌株在丙酸脅迫下的存活率提高了10倍多，丙酸產(chǎn)量提高了22%。丙氨酸脫羧酶系統(tǒng)的過(guò)表達(dá)不僅能促進(jìn)質(zhì)子消耗和CO2產(chǎn)生，更好的維持胞內(nèi)pHi平衡。而且改變了胞內(nèi)參與氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)的多個(gè)基因的表達(dá)水平以及胞內(nèi)的氨基酸池［80］。

11 結(jié)語(yǔ)

抗逆元件的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是改善微生物脅迫耐受性，進(jìn)而提高其生產(chǎn)性能的有效手段。極端微生物在自然脅迫條件下的長(zhǎng)期馴化，擁有了一套特殊、高效的脅迫響應(yīng)機(jī)制。因此，該類微生物中的抗逆元件常常具有更好的應(yīng)用效果（如熱激蛋白）。但目前研究者對(duì)極端微生物特有的脅迫響應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不全面，針對(duì)其基因組和胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)建立的大規(guī)模分子改造和合成的技術(shù)尚處于起步階段，極大地制約了極端微生物中抗逆元件的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

大量文獻(xiàn)證明，通過(guò)對(duì)同一類抗逆元件中重要基因的操作（過(guò)表達(dá)、敲除和突變）能顯著提高微生物的抗逆性能。多數(shù)情況下，多基因的組合操作比單基因的操作具有更明顯的效果。如釀酒酵母的鉀泵TRK1和質(zhì)子泵PMA1的共表達(dá)［65］、丙酮丁醇梭菌糖酵解途徑中的pfkA和pykA的共表達(dá)［61］、大腸桿菌的全局轉(zhuǎn)錄因子FadR和MarR的共敲除［72］、大腸桿菌的外膜蛋白OmpF的敲除和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FadL的表達(dá)［15］、酵母的海藻糖合成相關(guān)基因的表達(dá)（如otsA、otsB、treS、tps1和tps2）和海藻糖水解相關(guān)基因的敲除（如nth1、nth2和ath1）［56-59］等［7，63］。但也有一些例外的情況，如單獨(dú)表達(dá)硫酯酶GeoTE的重組大腸桿菌的游離脂肪酸耐受性高于單獨(dú)表達(dá)硫酯酶BTE重組大腸桿菌和共表達(dá)菌株，其中，GeoTE表達(dá)菌株的細(xì)胞存活數(shù)比BTE表達(dá)菌株和共表達(dá)菌株分別高出1和2個(gè)數(shù)量級(jí)［5］。外排泵SrpB過(guò)表達(dá)提高惡臭假單胞菌正丁醇耐受性的效果與SrpABC三基因共表達(dá)時(shí)相似，二者均高于其他兩個(gè)基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)［4］。

綜合文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)多種方法均能改善微生物的同一種抗逆性能，如研究者采取了調(diào)控細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、相容性溶質(zhì)、能量代謝、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、熱激蛋白等多種方法增強(qiáng)了不同微生物的乙醇耐受性。但這些方法具有各自的特點(diǎn)。其中，針對(duì)熱激蛋白、氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)等與一般脅迫響應(yīng)相關(guān)元件的操作方法，能更直接作用于菌株的抗逆性能，且不易對(duì)胞內(nèi)的其他生理系統(tǒng)和代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，而且，這類元件更易從極端微生物中獲得效果更好的基因。而針對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、相容性溶質(zhì)和能量相關(guān)元件的操作方法，容易對(duì)菌體生長(zhǎng)、胞內(nèi)多個(gè)代謝途徑甚至產(chǎn)物合成產(chǎn)生影響，尤其是基因之間復(fù)雜的相互作用。因此，在靶點(diǎn)選擇和操作方式上難度更大。一般來(lái)說(shuō)，多種方法同時(shí)使用的效果更好，如釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄因子HAA1與磷酸核糖焦磷酸合成酶PRS3的共表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同作用，其耐受性能、糖耗能力和乙醇產(chǎn)量均高于兩個(gè)基因單獨(dú)表達(dá)的情況［63］。研究者將人工轉(zhuǎn)錄因子（ATF）、脂肪酸合成基因（fabD）、離子吸收蛋白（FeoA）這些單個(gè)表達(dá)時(shí)均表現(xiàn)出良好效果的不同類型的抗逆元件進(jìn)行組合表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，菌株的最大丁醇耐受濃度提高到2%，而單獨(dú)表達(dá)人工轉(zhuǎn)錄因子的菌株的最大丁醇耐受濃度為1.5%［4］。但由于不同類型元件之間的合作機(jī)制尚未完全解析，一些組合操作的效果仍無(wú)法解釋，如外排泵元件（SrpABC）和脂肪酸合成基因共表達(dá)時(shí)，菌株在丁醇脅迫下的生長(zhǎng)性能反而受到明顯抑制，這一結(jié)果與單個(gè)元件表達(dá)均提高菌株耐受性的現(xiàn)象完全相反［4］。這些報(bào)道都充分說(shuō)明了抗逆機(jī)制的復(fù)雜性，也對(duì)高效微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建提出了更大的挑戰(zhàn)。此外，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，還應(yīng)考慮多種方法同時(shí)操作后對(duì)菌株生長(zhǎng)、生理代謝和產(chǎn)物合成造成的過(guò)大負(fù)擔(dān)和不利影響。

目前，針對(duì)大量的非模式微生物或工業(yè)生產(chǎn)菌株的高效、穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)還比較缺乏，尤其是用于基因表達(dá)水平精細(xì)和動(dòng)態(tài)調(diào)控或者多基因/大片段同步操作的分子工具。此外，抗逆元件的定向進(jìn)化、組合操作時(shí)多個(gè)元件表達(dá)水平之間的平衡和優(yōu)化也是需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。大量結(jié)果表明，利用比較組學(xué)數(shù)據(jù)篩選出來(lái)的顯著差異基因不一定具有良好的抗逆效果，菌株脅迫耐受性能的增加也不總能提高其生產(chǎn)性能。因此，需要采取系統(tǒng)生物學(xué)的思想，通過(guò)多組學(xué)技術(shù)、代謝工程操作和高通量篩選技術(shù)相結(jié)合的方法，挖掘大量具有重要應(yīng)用潛力的抗逆元件。這不僅能推動(dòng)微生物脅迫耐受機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)和全面解析，而且為高效微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供良好的理論指導(dǎo)和必要的調(diào)控元件。