李曉燕 李馳宇 于峰 廖紅東

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082）

基因表達(dá)調(diào)控是分子生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域，主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、mRNA翻譯、翻譯后調(diào)控4個(gè)方面［1］。隨著RNA-seq、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、紫外交聯(lián)免疫沉淀（Crosslinking-immunprecipi tation，CLIP）等技術(shù)的成熟，RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)［2］。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控包括RNA包裝加工、RNA可變剪接、RNA定位、RNA穩(wěn)定性、RNA翻譯等過程［3］，每個(gè)環(huán)節(jié)都需要RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的參與調(diào)節(jié)［4］。RBPs廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物體內(nèi)［5］。在微生物中，普城沙雷氏菌G3的RNA結(jié)合蛋白Hfq（a host factor for RNA phage）促進(jìn)YadA（Yersinia adher-ence protient）和InvA（Invasion on associated protein）mRNA與核糖體的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)了兩種粘連蛋白YadA和InvA的產(chǎn)生，增強(qiáng)菌體的適應(yīng)性［6］。在植物中，RNA結(jié)合蛋白HOS5（High Osmotic Stress Gene Expression 5） 結(jié) 合RS40（Serine/arginine-rich proteins） 的 前 體 mRNA， 調(diào)節(jié)其可變剪切，確保水稻對(duì)鹽脅迫的耐受［7］；甘氨酸富集的RNA結(jié)合蛋白AtRZ-1b結(jié)合FLC（Flowering Locus）的mRNA促進(jìn)FLC第一個(gè)內(nèi)含子高效剪接從而促進(jìn)擬南芥植物開花［8］。在動(dòng)物中，人類線粒體RNA結(jié)合蛋白C6orf203抑制OXPHOS（Oxidative phosphorylation）mRNA 與 核糖體結(jié)合，進(jìn)而抑制OXPHOS蛋白的合成［9］。直腸癌細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白HUR（Hu antigen R）通過腸上皮的核仁磷酸蛋白調(diào)節(jié)Rac1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1）mRNA 的 核 質(zhì) 穿 梭［10］。另 外，EBP1蛋 白 通 過 與AR（Androgen receptor）mRNA 3'-UTR富含UC的motif相互作用，促進(jìn)ARmRNA的降解，同時(shí)EBP1還與ARmRNA 5'編碼區(qū)的CAG莖環(huán)結(jié)合，抑制AR的翻譯，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［11］。

EBP1是受體酪氨酸激酶ErbB3（Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog）的磷酸化底物，是調(diào)控動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)重要的DNA和RNA結(jié)合蛋白。在動(dòng)物中，EBP1作為DNA結(jié)合蛋白與E2F1（E2F transcription factor1）基因的啟動(dòng)元件相互作用，抑制E2F1基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［12］。另外，EBP1也可作為RNA結(jié)合蛋白，以核糖核蛋白的形式發(fā)揮功能，不僅參與不同種類rRNA的成熟過程［13］，也可以綁定mRNA并調(diào)控其翻譯。例如，人類EBP1蛋白通過富含賴氨酸的基序361SASRKTQKKKKKKAS375與口蹄疫病毒的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（The internal ribosome entry site，IRES）相互作用，促進(jìn)48S起始復(fù)合物的形成［14］；EBP1也可以通過σ70-like motif（46-54氨基酸）結(jié)合5S rRNA，調(diào)控其成熟過程［15］。EBP1蛋白在動(dòng)物和植物中結(jié)構(gòu)和功能高度保守，已有報(bào)道EBP1在植物中也可以直接綁定DNA［16］。擬南芥EBP1蛋白直接綁定CML38啟動(dòng)子片段，抑制CML38基因表達(dá)［16］。最新質(zhì)譜結(jié)果顯示擬南芥EBP1參與核糖體生物生成、蛋白質(zhì)翻譯等過程，可以綁定mRNA、rRNA、snoRNA、tRNA等多種RNA［17］。但已報(bào)道的EBP1的靶基因甚少，EBP1綁定RNA的結(jié)構(gòu)域、參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具體機(jī)制目前仍不清楚。本研究通過RNAEMSA（RNA electrophoretic mobility shift assay） 等實(shí)驗(yàn)證實(shí)EBP1體外結(jié)合RNA，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了EBP1結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域，RIP實(shí)驗(yàn)找到 了 3個(gè)靶基 因 RNA（AT1G24792、AT3G25211、AT3G24320）。為了研究EBP1對(duì)靶RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，蟲草素處理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EBP1促進(jìn)AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解，而對(duì)AT3G25211的mRNA穩(wěn)定性沒有影響。通過核糖體提取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320的mRNA與核糖體結(jié)合，而促進(jìn)AT3G25211的mRNA與核糖體結(jié)合。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，擬南芥EBP1作為一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)控下游靶基因mRNA穩(wěn)定性與翻譯速率，為研究該蛋白的生物學(xué)功能提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 擬南芥野生型Col-0、ebp1-1（SALK_030408）、ebp1-2（SALK_052695）、ebp1-3（CS854731）、35S∷EBP1-GFP植物材料以及EBP1-pGEX-4T-1 BL21的菌種由中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李馳宇提供。將擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，點(diǎn)播在pH為5.8、含0.8%瓊脂的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，4℃春化3 d后，于22℃，長(zhǎng)日照（16 h光照/8 h黑暗）垂直放置培養(yǎng)7 d進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 GST-Resin（貨號(hào)：B074B）購于徐州博天生物有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）（貨號(hào)：A100487-0005）、卡那霉素（貨號(hào)：A506636-0025）以及氨芐青霉素（Amp）（貨號(hào)：410V033）、還原性谷胱甘肽（貨號(hào)：A100399-0025）、PMSF（貨號(hào) ：4100745-0005）均購于生工生物工程上海有限公司；Protein GFP Trap（貨號(hào)：SA070005）購于常州天地人和生物有限公司；蛋白酶抑制劑（貨號(hào)：B14001）、磷酸酶抑制劑（貨號(hào)：B15001）購于Selleck Chemicals；RNA酶抑制劑（貨號(hào)：N251A）、SYBR PremixTaqkit（貨號(hào) ：SQ121）均購于一諾唯真生物公司，Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：K168）；FITC修飾探針擎科生物公司合成，其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 EBP1一級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：將 TAIR網(wǎng) 站（https：//www.arabidopsis.org/）查 找的擬南芥EBP1（AT3G51800）的氨基酸序列導(dǎo)入Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org）預(yù)測(cè)EBP1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。EBP1晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：將EBP1氨基酸序列 輸 入 Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）網(wǎng)站進(jìn)行EBP1晶體三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，通過PyMOL軟件進(jìn)行顏色、結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)等修飾。RNA多序列比對(duì)分析：利用NCBI網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 的BLAST功 能， 以“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”序列為模版，進(jìn)行RNA多序列比對(duì)，獲得包含此RNA序列的潛在靶基因，并下載包含“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”長(zhǎng)度為60 bp的潛在靶mRNA序列，用Clustal X軟件（Invitrogen公司）進(jìn)行Alignment比對(duì)（參數(shù)為Multiple Mode Alignment、Font size10）導(dǎo)出 Fasta文件，再用Bio-Edit進(jìn)行顏色、字體、間距的美化。RIP實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)：在TAIR網(wǎng)查找以上潛在靶基因的cDNA，再通過Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)包含潛在結(jié)合區(qū)域的引物，于擎科生物公司合成，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（引物列表見表1）。

1.2.2 EBP1-GST蛋白誘導(dǎo) 將包含EBP1-pGEX-4T-1或pGEX-4T-1的BL21大腸桿菌蛋白表達(dá)菌株，以1∶1 000的比例接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL Amp）中，37℃，200 r/min 培養(yǎng) 12-16 h 后，以1∶100接種于200 mL含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)，至OD600=0.8，加入工作濃度為0.5 mmol/L的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG，28℃，100 r/min誘導(dǎo)6 h。

1.2.3 GST蛋白純化 將誘導(dǎo)好的EBP1-GST菌液分裝于50 mL離心管，4℃，5 000 r/min離心10min，去除上清。加入7 mL蛋白裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，pH 7.5）重懸菌體，冰上超聲破碎EBP1-GST菌體（功率200 W，超聲6 s，冷卻9 s，重復(fù)破碎約15 min至裂解液澄清）。超聲破碎后的懸液于4℃，6 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至10 mL Ep管中。取500 μL GST純化柱（GST agarose），用1 mL蛋白裂解緩沖液重懸GST純化柱，4℃，100 ×g離心1 min，去除上清，并重復(fù)該步驟3次洗去保護(hù)液。去除上清后，轉(zhuǎn)移到裝有細(xì)菌破碎液的10 mL Ep管，4℃旋轉(zhuǎn)孵育8 h。孵育后的液體，4℃，1 000 r/min 離心1 min，去除上清，并將GST純化柱轉(zhuǎn)移到2 mL Ep管，加入1 mL蛋白漂洗緩沖液（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl）重懸，4℃顛倒5 min，以洗去非特異性結(jié)合的蛋白，此過程重復(fù)3次。離心去上清后加入1 mL蛋白洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris pH 7.5，20 mmol/L GSH，150 mmol/L NaCl），4℃洗脫 3 h。取10 μL純化的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。

1.2.4 EBP1-GST與總RNA結(jié)合實(shí)驗(yàn) 取8 μL純化的EBP1-GST蛋白（以GST蛋白作為對(duì)照）加到100 μL總蛋白綁定緩沖液（150 mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.5 mmol/L EDTA，蛋白酶抑制劑）中，然后在總蛋白綁定緩沖液中分別加入50 μL的GST純化柱（已用總蛋白綁定緩沖液洗3次），4℃結(jié)合3 h后，用總蛋白綁定緩沖液洗3次，每次5 min，洗掉雜蛋白，備用。用TRIzol法提取擬南芥RNA，用36 μL水溶解，吸取2 μL檢測(cè)是否降解（質(zhì)量合格的RNA有3條帶，從大到小分別是28S、18S、5.8S）。將結(jié)合有EBP1-GST、GST蛋白的GST純化柱以及沒有孵育蛋白的GST純化柱中加入20 μL的RNA和100 μL總蛋白綁定緩沖液（包含8 U/mL RNA酶抑制劑）室溫孵育30 min，其余RNA存放于-80℃冰箱，用1 mL總蛋白綁定緩沖液將GST純化柱洗3次，洗去未結(jié)合的RNA，利用TRIzol法提取樣品中的RNA，取2 μL -80℃儲(chǔ)存的RNA，與其他實(shí)驗(yàn)樣品一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA含量，同時(shí)測(cè)定RNA濃度及OD260值［18］。

1.2.5 RIP實(shí)驗(yàn) 稱取生長(zhǎng)7 d的EBP1-GFP植物幼苗3 g，置于50 mL離心管中，用清水洗3次，加入35 mL 0.5%甲醛，立即真空固定5 min（壓力為9MPa），釋放真空，繼續(xù)固定8 min，然后加入1.5 mL 2 mol/L甘氨酸，抽真空1 min，釋放真空，再抽真空5 min（終止甲醛交聯(lián)反應(yīng)），釋放真空，清水洗5次，用吸水紙去除水分，液氮速凍。將幼苗在液氮中充分研磨，加入500 μL總蛋白提取液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，0.05%SDS，10 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1% 蛋白酶抑制劑，8 U/mL RNA酶抑制劑），冰上靜置1 h。4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清到新的1.5 mL Ep管，取100 μL植物抽提液作為Input，其余樣品分成兩份，一份作為對(duì)照組，一份作為實(shí)驗(yàn)組。取兩份40 μL GFP-Tarp，用RIP結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，0.1%SDS，1% TritionX-100）洗3次，去上清，加入300 μL RIP結(jié)合緩沖液和1 mL Chip稀釋緩沖液（16.7 mmol/L Tris-HCl pH 8，167 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L EDTA，1.1% TritionX-100，8 U/mL RNA酶抑制劑，1%蛋白酶抑制劑），再分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的植物抽提液，4℃結(jié)合過夜。將結(jié)合有蛋白的GFP-Tarp用RIP結(jié)合緩沖液洗3次以洗去雜蛋白，去上清后加入50 μL RIP洗脫緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，100 mmol/L EDTA，0.1% SDS，1 U/mL RNA 酶抑制劑），65℃振蕩10 min，離心后將上清轉(zhuǎn)移至新的Ep管，再向GFP-Tarp中加入50 μL RIP洗脫緩沖液，65℃振蕩10 min，將兩次上清合并，在Input以及上清加入1 μL 14 mg/mL蛋白酶K，56℃放置1 h，釋放結(jié)合的RNA，之后用TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為進(jìn)一步qRT-PCR的模板，以上試劑均用DEPC水配制。

1.2.6 RNA-EMSA實(shí)驗(yàn) 將100 ng純化的EBP1-GST蛋白（GST空載蛋白作為對(duì)照）和100 pg FITC熒光修飾的RNA探針（不帶FITC修飾的RNA競(jìng)爭(zhēng)探針作為對(duì)照）加入RNA-EMSA結(jié)合緩沖液（10mmol/L Tris，5%甘油，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mg/mL BSA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mg/mL polyglutamate pH 7.5）中，室溫放置20 min。用6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠（6.5%凝膠儲(chǔ)液，10%甘油，1%過硫酸銨，TEMED，0.5×TBE）先在冰上預(yù)電泳0.5 h，沖洗膠孔，上樣，電泳1 h后，用KODAK 4000M Image Station 顯影［19］。

1.2.7 蟲草素（cordycepin）處理實(shí)驗(yàn) 取1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的擬南芥幼苗，浸沒于CRD處理緩沖液（1 mmol/L哌嗪-1，4-二乙磺酸，1 mmol/L檸 檬 酸 鈉 pH 6.25，1 mmol/L KCl，15 mmol/L 蔗糖，150 μg/mL蟲草素）中，抽真空3 min后，繼續(xù)放置于22℃光照處理15 min、30 min、45 min后，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)［20］。

1.2.8 核糖體提取實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)7 d的擬南芥幼苗1g，用紙吸干，液氮充分研磨后，每個(gè)樣加入500 μL提取液（0.2 mol/L Tris-HCl pH 7.5，50 mmol/L KCl，25 mmol/L MgCl2，50 μg /mL 放線菌酮，50 μg/mL 蟲草素，400 U/mL RNA酶抑制劑，10 μL蛋白酶抑制劑Cocktail，1 mmol/L PMSF）冰上抽提30 min，同時(shí)在預(yù)冷的50 mL離心管鋪制10%-60%梯度的蔗糖，將植物提取液4℃，12 000 r/min離心10 min。取上清輕輕滴加在已鋪好的蔗糖上層，同時(shí)將沒有植物樣品各梯度蔗糖作為對(duì)照。4℃，32 000 r/min離心4 h。離心后取不同梯度組分，測(cè)定各個(gè)組分OD260吸光值。提取45%-60%蔗糖梯度組分的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)［21］。

1.2.9 RNA提取與qRT-PCR 用TRIzol法提取擬南芥總RNA后，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Bio-rad定 量PCR儀（C1000 TouchTMThermal Cycler）進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EBP1蛋白結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域分析

擬南芥EBP1一級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在48-56氨基酸區(qū)域存在結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域（圖1-A）。同時(shí)我們?cè)赑hyre2網(wǎng)站預(yù)測(cè)了其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人類與擬南芥EBP1于蛋白表面均含有兩個(gè)封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Loop）。擬南芥EBP1蛋白48-56氨基酸區(qū)域就位于Loop1環(huán)結(jié)構(gòu)中，并且此序列與人類EBP1報(bào)道的結(jié)合RNA的σ70-like motif（46-54氨基酸）序列類似（圖1-B），這暗示EBP1在結(jié)構(gòu)上具有結(jié)合RNA的潛能。

表1 引物列表

2.2 EBP1在體外直接綁定RNA

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EBP1蛋白是否可以直接結(jié)合RNA，我們首先進(jìn)行了總RNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)（圖2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GST蛋白結(jié)合的泳道（第三泳道）與對(duì)照組GST純化柱結(jié)合的泳道（第二泳道）RNA條帶亮度基本一致，EBP1-GST蛋白結(jié)合的RNA條帶（第四泳道）與第二泳道相比亮度明顯增強(qiáng)（圖2-A）。定量分析顯示，對(duì)照組GST純化柱、GST蛋白和EBP1-GST蛋白結(jié)合的RNA濃度分別是0.041 2 μg/μL、0.044 8 μg/μL、0.132 4 μg/μL（表 2）。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明EBP1-GST蛋白結(jié)合RNA的濃度明顯高于對(duì)照組（P<0.05），而GST蛋白與對(duì)照組基本一致（P>0.05），即EBP1-GST可以結(jié)合部分RNA，GST蛋白不能結(jié)合RNA。

圖1 EBP1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

進(jìn)一步表達(dá)并純化了EBP1-GST蛋白（圖2-B），然后合成FITC修飾的探針“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”（Probes）以及不修飾的探針“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”（Competitor），通 過與EBP1-GST、GST蛋白孵育，同時(shí)用50倍和100倍的不修飾的特異性探針（Competitor）進(jìn)行RNAEMSA實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照組GST純化柱（第一泳道）和GST（第二泳道）蛋白與探針孵育的泳道沒有出現(xiàn)遷移的電泳條帶，EBP1-GST與探針孵育泳道（第三泳道），顯示出明顯遷移的電泳條帶，且條帶的強(qiáng)度隨著競(jìng)爭(zhēng)性探針（Competitor）濃度的升高而減弱（第四、五泳道）。表明GST蛋白不能結(jié)合RNA，而EBP1蛋白可以直接綁定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”這一RNA序列（圖2-C）。

表2 樣品濃度及吸光值

圖2 EBP1蛋白與RNA直接相互作用

2.3 在擬南芥體內(nèi)EBP1綁定RNA

為了進(jìn)一步驗(yàn)證擬南芥EBP1在體內(nèi)結(jié)合RNA，首先通過NCBI網(wǎng)站Blast找到12個(gè)基因含有“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”序列（圖3-A）：AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211、AT1G07150、AT1G11810、AT5G55950、AT3G13830、AT3G14400、AT3G17265、AT3G21120、AT3G63200、AT3G24700，利用實(shí)驗(yàn)室已有的EBP1-GFP轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株，結(jié)合RIP技術(shù)，對(duì)這12個(gè)潛在EBP1靶mRNA進(jìn)行了RIP-qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示：AT1G24792被對(duì)照組GFP-Trap免疫沉淀的RNA相對(duì)含量是2.623 40，被實(shí)驗(yàn)組EBP1-GFP免疫沉淀的RNA相對(duì)含量5.094 07；AT3G24320被免疫沉淀的RNA在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)含量分別是2.936 38、13.318 90。AT1G25211被免疫沉淀的RNA在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)含量分別是3.462 92、9.613 54，這3個(gè)基因的mRNA被EBP1-GFP免疫沉淀后相比對(duì)照組有顯著性差異（AT1G24792，P<0.05；AT3G24320，P<0.001；AT1G25211，P<0.01），其他9個(gè)基因被EBP1-GFP免疫沉淀的RNA相比對(duì)照沒有顯著性差異（P>0.05）（圖3-B）。表明EBP1結(jié)合AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211的 RNA， 并可能參與其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。

2.4 EBP1調(diào)控靶RNA的穩(wěn)定性

為了研究EBP1對(duì)靶RNA轉(zhuǎn)錄后事件的調(diào)控，首先我們分析了EBP1對(duì)基因AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211在RNA穩(wěn)定性方面的影響。利用蟲草素這種轉(zhuǎn)錄抑制劑，結(jié)合qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)靶RNA的降解速度，進(jìn)而分析RNA的穩(wěn)定性。于是對(duì)Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株用蟲草素處理后，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。ATHSPRO2基因是一個(gè)已被報(bào)道m(xù)RNA不穩(wěn)定的基因，蟲草素處理后ATHSPRO2mRNA會(huì)迅速降解，證明蟲草素處理有效（圖 4-A）。Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株在蟲草素處理0 min時(shí)這3個(gè)靶基因的mRNA含量均為1。相對(duì)于0 min mRNA含量，EBP1突變后AT1G24792mRNA的含量在蟲草素處理30 min、45 min分別為0.574 7、0.218，而對(duì)照組Col-0中AT1G24792mRNA分別是0.33、0.03，過表達(dá)EBP1-GFP AT1G24792mRNA含量在30 min、45 min分別為0.301 58、0.046 03（圖4-B）；EBP1突變后AT3G24320mRNA在處理15 min、30 min后含量分別為0.222、0.191 1，對(duì)照組Col-0中AT3G24320mRNA在蟲草素處理15 min、30 min時(shí)的相對(duì)含量是0.642 8、0.33，過表達(dá)EBP1-GFP AT3G24320mRNA 含量在 15 min、30 min 分別為 0.202 5、0.13（圖4-C）；EBP1突變后蟲草素處理15 min、45 min后AT1G25211mRNA相對(duì)含量分別是0.807 3、0.218 4，Col-0被蟲草素處理15 min、45 min后AT1G25211mRNA相對(duì)含量分別是0.802 0、0.263 9（圖4-D）。以上數(shù)據(jù)表明：EBP1促進(jìn)AT1G24792、AT3G24320mRNA的降解，而對(duì)AT1G25211mRNA的穩(wěn)定性沒有影響。

圖3 EBP1在體內(nèi)與特定基因的mRNA相互作用

進(jìn)一步我們通過qRT-PCR手段檢測(cè)Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP植物中靶mRNA的含量（圖4-E-G）。數(shù)據(jù)顯示AT1G24792mRNA在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP的相對(duì)含量為1.660 57、4.297 34、5.955 5、1.904 86、0.873 17，即AT1G24792mRNA在ebp1-1、ebp1-2中明顯增多（P<0.05），而在過表達(dá)中mRNA沒有顯著改變（P>0.05）（圖 4-E）。AT3G24320的 mRNA相對(duì)含 量 在 Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分 別 為 1.034 72、2.661 91、2.310 78、4.561 03、0.392 15，即EBP1突變后AT3G24320mRNA的含量增加（P<0.05），EBP1過表達(dá)AT3G24320mRNA的含量減少（P<0.05）（圖4-F）。AT1G25211的mRNA相對(duì)含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分別為 1、0.567 20、0.426 91、0.659 82、1.466 62，表明EBP1對(duì)AT1G25211的mRNA含量沒有顯著影響（P>0.05）（圖 4-G）。

綜合RNA穩(wěn)定性和植物中靶mRNA表達(dá)量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)EBP1突變后AT1G24792、AT3G24320的mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而使這些基因的mRNA含量增加，即EBP1可以調(diào)控靶RNA的穩(wěn)定性。

2.5 EBP1調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯速率

為了探究在擬南芥中EBP1是否對(duì)核糖體的成熟、mRNA的翻譯速率起調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)通過蔗糖密度梯度離心分離核糖體來檢測(cè)EBP1對(duì)3個(gè)靶基因mRNA翻譯速率的影響。數(shù)據(jù)顯示：AT1G24792在ebp1-1的多聚核糖體組分（8-11）中mRNA的相對(duì)含量分別是1.53、0.95、1.71、1.02，在Col-0植物的多聚核糖體組分（8-11）中相對(duì)含量是0.94、0.43、1、0.91（圖5-B）；AT3G24320在ebp1-1的多聚核糖體組分（8-11）中mRNA的相對(duì)含量分別是2.31、4.69、4.39、2.62，在Col-0植物的多聚核糖體組分（8-11）中相對(duì)含量是0.95、2.34、2.65、1.38（圖5-C）；AT1G25211在ebp1-1的多聚核糖體組分（8-11）中mRNA的相對(duì)含量分別是0.76、0.75、1.15、1.05，在Col-0植物的多聚核糖體組分（8-11）中mRNA的相對(duì)含量是1.28、1.91、1.51、1.39（圖5-D）；以上數(shù)據(jù)表明EBP1突變與對(duì)照Col-0比可以促進(jìn)多聚核糖體組分中AT1G24792、AT3G24320mRNA增多（P<0.05），而多聚核糖體結(jié)合AT1G25211的mRNA明 顯 減 少（P<0.05）， 即 EBP1抑 制AT1G24792、AT3G24320的mRNA與核糖體的結(jié)合，促進(jìn)AT1G25211mRNA與核糖體的結(jié)合。因此植物中EBP1也可以調(diào)控mRNA的翻譯過程。

3 討論

RBPs通過與RNA相互作用在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。植物擁有復(fù)雜的RBPs系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的多個(gè)過程，包括調(diào)控開花時(shí)間［22］、激素反應(yīng)［23］、生物鐘［24］、生物［25］及非生物脅迫［26］等過程。研究RBPs的生物學(xué)功能并解析其調(diào)控的分子機(jī)制將有助于挖掘新的功能基因，為農(nóng)作物改良提供新的種質(zhì)資源。

RNA與蛋白質(zhì)的相互作用通常是通過一個(gè)特異的RNA識(shí)別基序?qū)崿F(xiàn)的，F(xiàn)oley等［27］利用蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)對(duì)擬南芥有根毛和無根毛細(xì)胞核中的RBPs進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”可能是EBP1潛在的靶RNA序列。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥EBP1蛋白可以直接綁定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA序列，并且找到了EBP1的3個(gè)靶基因RNA（AT1G24792、AT3G24320、AT1G-25211），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EBP1可以調(diào)控AT1G24792和AT3G24320的mRNA穩(wěn)定性，對(duì)AT1G25211的mRNA穩(wěn)定性沒有明顯影響。在此過程中EBP1如何實(shí)現(xiàn)對(duì)靶RNA的特異性識(shí)別與結(jié)合，是否還有更多的靶RNA沒有被發(fā)現(xiàn)，今后可綜合RIP-seq等技術(shù)，篩選更多與EBP1相互作用的RNA。另外，RNA結(jié)合蛋白通過識(shí)別位于mRNA 3'UTR富含AU的區(qū)域途徑或者識(shí)別含有提前終止密碼子的mRNA的 NMD（Nonsense-mediated mRNA decay） 等 途 徑來影響靶RNA的穩(wěn)定性［28］。然而EBP1是如何調(diào)控AT1G24792和AT3G24320的mRNA穩(wěn)定性的目前還不清楚，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖5 EBP1調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯效率

EBP1在動(dòng)植物中是受體酪氨酸激酶ErbB3磷酸化調(diào)控的核質(zhì)穿梭蛋白［29-30］。哺乳動(dòng)物中，ErbB3是 HRG/NRG（Heregulin/neuregulin）小肽的受體［31］。在乳腺癌細(xì)胞中，當(dāng)HRG 配體小肽結(jié)合ErbB3受體時(shí)，ErbB3與EBP1相互作用，使EBP1磷酸化并促使其在細(xì)胞核積累，發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分化的功能［32］。植物中EBP1作為核質(zhì)穿梭的轉(zhuǎn)錄因子，其功能已有研究。CrRLK1L（Catbarantbus roseusRLK1-like）成員FERONIA感知RALF1（Rapid Alkalinization Factor 1）小肽信號(hào)后，F(xiàn)ERONIA與EBP1相互作用，使EBP1磷酸化并在細(xì)胞核積累，EBP1入核后抑制CML38的轉(zhuǎn)錄［16］。EBP1磷酸化狀態(tài)的改變是否影響其對(duì)轉(zhuǎn)錄后事件的調(diào)控仍不清楚。EBP1對(duì)RNA穩(wěn)定性、mRNA翻譯的調(diào)控過程是否受到上游磷酸化蛋白調(diào)控也需要進(jìn)一步研究。報(bào)道顯示擬南EBP1與核糖體的結(jié)合分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及核仁之間，且EBP1可以結(jié)合不同種類的RNA［17］，EBP1蛋白在調(diào)控植物器官大小、逆境脅迫等多個(gè)方面發(fā)揮功能［16］，那么，EBP1在不同的位置結(jié)合核糖體所行使的功能有何差異，其是否是通過改變蛋白構(gòu)象或結(jié)合特定的基序來識(shí)別不同的RNA，從而實(shí)現(xiàn)不同的功能？所以，結(jié)合遺傳學(xué)多層次探究EBP1在RNA水平調(diào)控的生物學(xué)意義，是今后需要關(guān)注和研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過運(yùn)用生物信息學(xué)分析結(jié)合分子生物學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)擬南芥EBP1作為一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，在RNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控過程中發(fā)揮功能。EBP1可以直接綁定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA基序；生物信息學(xué)分析結(jié)合RIP-qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了EBP1的3個(gè)靶基因RNA（AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211）；進(jìn)一步通過蟲草素處理發(fā)現(xiàn)擬南芥EBP1促進(jìn)AT1G24792、AT3G24320mRNA的降解，而對(duì)AT1G25211mRNA的穩(wěn)定性沒有影響。核糖體提取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320與核糖體的結(jié)合，而促進(jìn)AT1G25211與核糖體結(jié)合。因此，EBP1在擬南芥中可以與RNA相互作用，并具有調(diào)控靶RNA的穩(wěn)定性和翻譯速率的生物學(xué)功能。