楊敏 李舒婷 楊文平 李相陽 許文濤

（1. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

貴金屬納米團簇是由 Au、Ag和Pt 等貴金屬元素組成的分子聚集體，一般由幾個到幾十個原子組成。金屬納米團簇的理化性質(zhì)對其物理尺寸有強烈的依賴性，當(dāng)尺寸接近電子的費米波長（金和銀約0.5 nm），連續(xù)的密度態(tài)分裂成類似于分子的不連續(xù)的能級，與激發(fā)光相互作用時電子能夠在能級之間轉(zhuǎn)換，進而能發(fā)出強烈的熒光［1］，顯現(xiàn)出獨特的電學(xué)和光學(xué)性能［2］。其中，以DNA為模板的銀納米簇（Ag NCs）由于其高熒光量子產(chǎn)率（> 50%），良好的光穩(wěn)定性，低毒性，生物相容性，易合成等優(yōu)點而引起了廣泛關(guān)注［3］?；诖耍疚膶NA / Ag NCs在生物傳感器及其應(yīng)用方面的研究展開綜述，并著重介紹了其在細胞成像及抑菌方面的應(yīng)用，最后總結(jié)了DNA / Ag NCs生物傳感器目前存在的不足和未來發(fā)展的趨勢，以期為研究者提供借鑒。

1 DNA/銀納米簇的制備及基本性質(zhì)

1.1 DNA/銀納米簇的制備方法

DNA，特別是胞嘧啶堿基C與銀離子之間有強烈的親和性［4］，有證據(jù)表明迄今為止最成功的AgNCs就是用 DNA 為模板合成的，這種強烈親和性使得銀離子能夠維持雙鏈DNA的胞嘧啶之間C-C的錯配［5］。并且該方法制備條件溫和，制備的銀納米簇?zé)晒庑再|(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好，這些優(yōu)點使得DNA穩(wěn)定的銀納米簇的研究最為廣泛。

Zheng等［6］首次報道了用DNA為模板合成熒光銀納米簇，以含有12個堿基5'-AGGTCGCCGCCC-3'的DNA序列為模板，磷酸緩沖液為反應(yīng)體系的緩沖液，NaBH4作為還原劑，在冰浴條件下合成了熒光銀納米簇，制備出的熒光銀納米簇穩(wěn)定性好、溶于水、顆粒均勻。該Ag NCs在400 nm-550 nm有強的紫外吸收峰，在630 nm左右有熒光發(fā)射，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示所合成的Ag NCs只有1-4個Ag原子。后續(xù)的多次研究又強調(diào)了堿基種類、堿基序列以及 DNA的二級結(jié)構(gòu)對合成DNA穩(wěn)定的Ag NCs的關(guān)鍵作用［7-10］。隨后 O’Neill等［11］報道了用發(fā)卡狀 DNA（環(huán)上含 3-12個C）合成發(fā)熒光的Ag NCs，結(jié)果表明，環(huán)上C的數(shù)量可以調(diào)節(jié)所得Ag NCs的穩(wěn)定性和熒光。因此，很多用于合成 DNA / Ag NCs 的模板都是富含胞嘧啶的單鏈DNA（ssDNA）或者是包含一段C環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNA 和雙鏈DNA（dsDNA）。之后，Huang等［12］發(fā)現(xiàn)含錯配堿基對的雙鏈DNA 也被用于位點特異性的Ag NCs的合成，分子規(guī)模的Ag NCs位于錯配堿基對附近，而整體DNA還保持完整結(jié)構(gòu)。

1.2 DNA/銀納米簇的表征

由于合成Ag NCs的DNA寡核苷酸的單分散性，使用電噴霧質(zhì)譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）可以精確地確定納米團簇的化學(xué)計量學(xué)［13］。紫外-可見吸收光譜可以用來測定Ag NCs的最大吸收波長；熒光光譜可通過熒光分光光度計來獲得，從而獲得Ag NCs的熒光發(fā)射情況；Ag NCs的形貌和大小可借助透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）來觀察和測量［14］。紫外可見光譜和圓二色光譜均可用來探討Ag NCs的結(jié)構(gòu)變化及其熒光變化機制［15］。

2 多色DNA/銀納米簇的調(diào)控機制

Ag NCs周圍的配體/堿基環(huán)境是決定熒光發(fā)射顏色的重要因素，成核序列不同以及靠近Ag NCs的序列（增強子序列）不一樣，Ag NCs產(chǎn)生的熒光都可能會不一樣。目前DNA / AgNCs的熒光發(fā)射有四種主要的顏色，分別為紅、黃、藍、綠，如圖1所示。此外還有近紅外發(fā)射光。據(jù)報道，DNA / AgNCs由一個由Ag+離子包圍的核心/群中性Ag原子組成。中性原子的數(shù)目決定了原子團簇的發(fā)射波長，而Ag+離子將核心和DNA堿基“黏合”在一起［16-17］。Copp等［18］先前證明綠色和紅色發(fā)射往往分別與4個和6個中性核心銀原子有關(guān)。此后，該團隊又基于質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)DNA / Ag NCs的紅色發(fā)射極含有6個中性的Ag原子和8個Ag+離子，綠色發(fā)射極含有4個中性的Ag原子。這意味著兩個Ag原子從原始紅色發(fā)射極的核心氧化成Ag+，從而導(dǎo)致熒光顏色的轉(zhuǎn)變［19］。

圖1 DNA/銀納米簇4種主要的熒光顏色

Dickson課題組［20］以不同的DNA序列為模板合成的具有不同顏色的熒光發(fā)射的熒光銀納米簇光譜，如表1所示，這些銀納米簇模板都以C12為基礎(chǔ)，通過變動中間部分的堿基類型和順序，合成的熒光銀納米簇的熒光發(fā)射光譜從可見光區(qū)域跨越到近紅外區(qū)域。

表1 五種不同單鏈DNA序列為模板穩(wěn)定的銀納米簇的發(fā)射光

Sengupta等［21］小組利用3種不同序列的DNA（dT12、dT4C4T4和dC4T4C4）探討了銀納米簇的激發(fā)波長對堿基序列的選擇性。光譜分析表明以聚T堿基的DNA為模板合成的銀納米簇發(fā)出藍色或綠色熒光，而以聚C堿基的DNA為模板的銀納米簇除了可以發(fā)出藍、綠熒光，還可以發(fā)出紅色熒光。對dC4T4C4進行了研究表明簇的形成取決于寡核苷酸的濃度，較高的濃度有利于紅色熒光的產(chǎn)生，在較低濃度的dC4T4C4中，一種藍色/綠色的熒光納米簇占主導(dǎo)地位。

2011年，Yeh團隊［22］表明當(dāng)DNA / Ag NCs與富含鳥嘌呤的DNA鏈靠近時，可以使Ag NCs的熒光從無到有，發(fā)出強的紅色熒光，或使紅色熒光增強，這依賴于Forster能量轉(zhuǎn)移作為熒光開/關(guān)（on /off）切換機制，且鳥嘌呤N7位點在觀察到的紅色熒光增強中起關(guān)鍵作用。當(dāng)Ag NCs與富含胸腺嘧啶的DNA鏈鄰近時，產(chǎn)生綠色熒光增強，而富含腺嘌呤的DNA鏈鄰近時沒有產(chǎn)生任何可測量的熒光增強。

Li等［23］的研究表明，在充滿高密度葡聚糖的擁擠環(huán)境中制備的銀納米團簇與水溶液相比，具有更小的粒徑和更高的熒光量子產(chǎn)率。Cerretani等［24］的研究表明，5'-TTCCCACCCACCCCGGCCCGT-3'能穩(wěn)定紅色和綠色發(fā)射極，并可通過加入H2O2或NaBH4引發(fā)兩團簇之間的切換。此外，一些非熒光中間體物質(zhì)的形成會限制兩個發(fā)射器之間的完全可逆性。

3 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸傳感器

3.1 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“turn-on”型功能核酸熒光生物傳感器

核酸探針是指帶有標(biāo)記物的序列已知的核酸片段，它可以與其互補的核酸序列雜交形成雙鏈。以DNA為模板生成的Ag NCs是目前一種新興的熒光探針，它比半導(dǎo)體量子點具有更小的體積，并且能比常用的有機染料有更好的光穩(wěn)定性和亮度［16］。當(dāng)Ag NCs足夠小時，它們表現(xiàn)出很強的光吸收和發(fā)射能力，這使得它們幾乎成為單分子光譜中理想的熒光基團［22］。另外，Ag NCs由于其光譜特性高度依賴于DNA的序列和結(jié)構(gòu)，已被研究者廣泛應(yīng)用于構(gòu)建功能核酸熒光生物傳感器來進行生物分析。

3.1.1 無信號放大策略 在2011年，Kun等［25］發(fā)現(xiàn)DNA雙鏈中的堿基缺失位點（AP位點）可以作為Ag NCs生成的支架，在含AP位點的DNA雙鏈中，熒光Ag NCs的形成對AP位點表面的胞嘧啶和位點側(cè)面的鳥嘌呤具有高度選擇性?；贏g NCs形成對AP位點微環(huán)境的依賴性，作者構(gòu)建了一個“signalon”熒光傳感平臺用于DNA單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotide polymorphism，SNP）的檢測。當(dāng)存在靶標(biāo)鏈時，靶標(biāo)鏈與探針結(jié)合，在AP位點處可形成Ag NCs，在670 nm波長處發(fā)出強熒光；當(dāng)靶標(biāo)鏈發(fā)生單堿基突變時，在AP位點處無法生成Ag NCs，無熒光產(chǎn)生。熒光Ag NCs對AP位點周圍序列的強烈依賴性已成功地用于鑒定癌癥抑制基因p53的密碼子177中的突變。

Zhu等［26］開發(fā)了一種新型的DNA / Ag NCs探針，用于基于TdT介導(dǎo)的聚合和支架鏈置換反應(yīng)的原位凋亡細胞檢測和成像。為了制備開啟熒光DNA/ AgNC探針，應(yīng)用含有兩個結(jié)構(gòu)域I和II的單鏈DNA S1。富含胞嘧啶的結(jié)構(gòu)域I對Ag+表現(xiàn)出強親和力，可以容易地制備熒光核酸穩(wěn)定的Ag NCs。由于結(jié)構(gòu)域II與BHQ標(biāo)記的DNA S2部分雜交，猝滅劑位于Ag NCs附近，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）有效淬滅DNA / Ag NCs的熒光。在凋亡細胞的細胞核中，TdT分別使用DSB和dATP作為引物和底物，將poly-dA添加到DSB的3'-OH末端。然后，細長的poly-dA鏈與DNA / Ag NCs探針的3'ploy-T突出端雜交，并啟動前端鏈置換。由靶poly-dA DNA鏈引發(fā)的鏈置換從DNA / Ag NC探針釋放猝滅劑標(biāo)記的DNA，導(dǎo)致DNA / Ag NCs的顯著熒光點亮，用于敏感檢測細胞凋亡。該方法可以在體外檢測至少20個凋亡細胞。

3.1.2 有信號放大策略

3.1.2.1 鳥嘌呤接近 根據(jù)鳥嘌呤靠近使得熒光增強呈現(xiàn)的是一種“turn-on”的模式，當(dāng)不存在目標(biāo)分析物時，熒光銀納米簇與富含鳥嘌呤的增強序列是呈現(xiàn)完全分離的狀態(tài)，所以背景熒光信號非常低。Yeh等［27］發(fā)現(xiàn)以CCCTTAATCCCC為模板合成的銀納米簇，當(dāng)模版延長部分序列與一段包含有富G序列的DNA雜交后，能夠得到熒光強度增強了500倍的紅色熒光銀簇。在此基礎(chǔ)上，該團隊還設(shè)計一個變色的銀納米簇探針（cNCB），在銀納米簇、富G序列和待測序列同時存在時產(chǎn)生橘色的銀納米簇?zé)晒猓?dāng)待測序列的其中一個堿基發(fā)生突變后會產(chǎn)生紅色的銀納米簇?zé)晒?，兩種不同情況下合成的銀納米簇?zé)晒獍l(fā)射波長卻相差幾十納米，因而實現(xiàn)對單堿基突變的檢測［28］。

Li等［29］提出了一種結(jié)合誘導(dǎo)熒光激活法來檢測α-淀粉酶，使用兩種適體（Apt15和Apt29），并通過序列元件進行修飾。使用12個核苷酸序列將第一個適體與5'末端的納米簇成核序列連接起來。第二個適體通過互補序列與3'末端的富含G的突出端連接。兩個適體探針與靶蛋白的結(jié)合啟動與每個適體連接的互補接頭序列之間的雜交，從而使富含G的突出端與Ag NCs緊密接近，導(dǎo)致顯著的熒光增強。通過該方法，對于人α-凝血酶，實現(xiàn)了1 nmol/L的檢測限和5 nmol/L-2 μmol/L的線性動態(tài)范圍。

3.1.2.2 金屬離子 Zhang等［30］報道了基于DNA /Ag NCs的信號增強熒光適體傳感器，用于同時檢測赭曲霉毒素A（Ochratoxin a，OTA）和黃曲霉毒素B 1（AFB 1）。在添加Zn2+后，熒光強度明顯增加，從而使OTA的檢出限低至0.2 pg/mL，AFB1的檢出限低至0.3 pg/mL。Lee等［31］用Ag+來觸發(fā)DNA/ Ag NCs的熒光從弱紅色轉(zhuǎn)換為強綠色來檢測Ag+。Ag+通過在兩個Cyt12/ Ag NCs之間形成橋，誘導(dǎo)Cyt12/ Ag NCs二聚體結(jié)構(gòu)的形成，這種二聚體的形成使Cyt12-Ag NCs的熒光從紅色變?yōu)榫G色。使用這種Ag+觸發(fā)的熒光轉(zhuǎn)換可檢測到濃度低至10 nmol/L的Ag+。

3.1.2.3 與其他納米材料結(jié)合 Khan等［32］開發(fā)了一種基于適配體銀納米簇（DNA / Ag NCs）/二硫化鉬納米片（MoS2）的熒光檢測真菌毒素T-2的方法。使用的DNA鏈包含3段，包括穩(wěn)定銀簇片段（C12）、連接片段和T-2毒素適配體片段。以此DNA合成發(fā)紅色熒光的銀納米簇會吸附到二硫化鉬納米片表面，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），造成熒光猝滅。而目標(biāo)物存在時，由于適配體作用，會把銀簇從納米片表面拉開，F(xiàn)RET作用失效，熒光恢復(fù)?；诖嗽?，對T-2進行了靈敏性檢測。動態(tài)定量范圍為0.005 ng/mL-500 ng/mL，檢測線為0.93 pg/mL。

3.2 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“turn-off”型功能核酸生物傳感器

3.2.1 生物大分子 Yang等［33］利用DNA納米銀簇（DNA / Ag NCs）的熒光特性，開發(fā)了一種能夠高特異性檢測靶miRNA存在的DNA / Ag NCs探針。首先設(shè)計了一條DNA序列，它具有針對靶miRNA的特異性互補序列和用于產(chǎn)生紅色發(fā)射Ag NCs的12個核苷酸的支架。當(dāng)存在靶miRNA時，DNA /Ag NCs探針的發(fā)射顯著低于不存在靶miRNA或其他miRNA的情況。

作為生物硫醇，Cys在其參與可逆氧化還原反應(yīng)、解毒和代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。Wang等［34］開發(fā)了一種簡單的Cys檢測方法，檢測系統(tǒng)由DNA / Ag NCs和Cys檢測靶組成。DNA鏈由成核序列和富含G的適體序列組成，富含G序列的存在可以顯著增強Ag NCs的熒光信號，利用此DNA鏈作為模板合成一種具有強熒光信號的銀簇納米材料。在Cys或其他生物硫醇的存在下，由于S-Ag鍵的產(chǎn)生，DNA / Ag NCs的熒光可以被強烈猝滅。該方法對Cys的線性檢測范圍為0.1 nmol/L-100 nmol/L，檢測限為0.05 nmol/L。

3.2.2 金屬離子 Peng等［35］設(shè)計了一種新的熒光寡核苷酸穩(wěn)定的銀納米團簇（DNA / Ag NCs）探針，用于靈敏檢測汞和銅離子。該探針含有兩個定制的DNA序列。一種是信號探針，其含有富含胞嘧啶的序列模板，用于Ag NCs合成和兩端的連接序列。另一種是富含鳥嘌呤的序列，用于信號增強和與信號探針的連接序列互補的連接序列。雜交后，基于DNA / Ag NCs在富含鳥嘌呤的DNA序列附近的熒光增強效應(yīng)，雜交的雙鏈DNA / Ag NCs的熒光增強了200倍并且比單鏈DNA / Ag NCs穩(wěn)定。在Hg2+或Cu2+存在的情況下可以猝滅其熒光，因此可以用作檢測汞和銅離子的新型熒光探針，線性檢測6.0-160.0和6 nmol/L-240 nmol/L范圍內(nèi)的汞和銅離子，檢測限分別為2.1 nmol/L和3.4 nmol/L。

3.2.3 小分子 Ding等［36］提出了DNA模板銅/銀納米簇（DNA-Cu / Ag NCs）熒光探針用于選擇性檢測 S2-。 用 DNA 模 板（5'-CCCTTAATCCCC-3'） 合成具有優(yōu)異熒光特性的DNA-Cu / Ag NCs熒光探針。然而，一旦引入含有S2-的溶液，由于硫離子與銀和銅原子具有強親和力，熒光DNA-Cu / Ag NCs探針的結(jié)構(gòu)變化誘導(dǎo)其熒光淬滅。通過DNA-Cu / Ag NCs檢測的熒光強度的變化定量檢測S2-的濃度。所提出的方法允許在10 pmol/L-1 mmol/L的S2-濃度范圍內(nèi)使用，檢測線為3.75 pmol/L。

3.3 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“比率型”功能核酸熒光生物傳感器

大多數(shù)Ag NCs只具有單一的熒光信號，阻礙了Ag NCs探針的實際應(yīng)用和發(fā)展。因此，具有多個發(fā)射峰的變色龍Ag NCs為敏感的比率目標(biāo)檢測提供了一種新的可能性。Zhou等［15］設(shè)計了一種新型的變色龍DNA模板Ag NCs，其熒光顏色可以通過互補DNA、非熒光輔助Ag NCs和Mg2+的調(diào)控在黃色、橙色和紅色之間進行切換。以A20-C55為模板的Ag NCs（A20-C55-NC）在磷酸鹽緩沖溶液中具有強黃色熒光（Y信號）。當(dāng)通過模板雜交靠近無熒光輔助Ag NCs時，Y信號減少而新的紅色發(fā)射（R信號）上升，導(dǎo)致Ag NCs溶液從黃色到紅色的顯著顏色變化；另一方面，A20-C55-NC與互補DNA（T20）的雜交大大增強了Y信號；而A20-C55-NC在Mg2+存在下同時顯示出具有相同強度的R和Y信號；因此，變色龍Ag NCs實現(xiàn)了可控的多色熒光變化，無論是在雙鏈還是發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，比率探針都顯示出具有納摩爾敏感性的信號響應(yīng)指數(shù)生長。

Wang等［37］構(gòu)建了一種為單一熒光團的新型比率熒光納米傳感器已成功構(gòu)建，用于超靈敏和特異性檢測Pb2+。G-DNA的G1區(qū)段與R-DNA的R1區(qū)段雜交，形成含有Pb2+依賴的DNAzyme的雙鏈體。G-DNA的G2區(qū)段模板化Ag NCs（G-DNA / Ag NCs）發(fā)射綠色熒光。同時，G2-1的片段與R2-1片段的雜交，不僅有助于穩(wěn)定Pb2+依賴的DNAzyme的構(gòu)型而且還使R2富G序列接近形成的G-DNA / Ag NCs，將綠色發(fā)射G-DNA / Ag NCs轉(zhuǎn)化為紅色。dsDNA/ Ag NCs含有Pb2+依賴的DNAzyme的rA切割位點，在Pb2+存在下，特異性DNA片段將從dsDNA/ Ag NCs釋放，導(dǎo)致DNA / Ag NCs從紅色變?yōu)榫G色，由于Pb2+可以連續(xù)切割rA位點，因此從紅色到綠色發(fā)射的信號變化被放大。該傳感器從0.001 nmol/L-10 nmol/L表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，Pb2+測定的檢出限為1.0 pmol/L，低于大多數(shù)檢測Pb2+生物傳感器。

3.4 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器因具有操作簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可實時監(jiān)測等優(yōu)點，在食品安全、環(huán)境檢測、轉(zhuǎn)基因測定、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域日益得到了科研工作者的重視。而金屬納米粒子一般具有較好的導(dǎo)電性能，催化性能及吸附能力，可以大大提高傳感器的靈敏度。Jie等［38］利用雙功能Ag NCs和多重擴增策略，合成了新型Ag NCs并將其用作多功能電化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)信號探針。在長dsDNA模板修飾的電極上原位合成了大量Ag NCs，放大了電化學(xué)發(fā)光信號，用于靈敏檢測凝血酶。DPV峰電流顯示出與1.0 fmol/L-10.0 nmol/L的目標(biāo)濃度的對數(shù)線性依賴性，測限在3σ時為0.1 fmol/L。

Quan等［39］開發(fā)了一種基于銀納米團簇（Ag NCs）/辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）納米復(fù)合物（Ag NCs-HRP）的納米探針，用于癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的電化學(xué)檢測。通過含有CEA適體和C12的DNA模板合成Ag NCs。隨著HRP吸附到Ag NCs上，形成了可以與CEA特異性結(jié)合的納米探針（Ag NCs-HRP）。將抗CEA抗體，CEA和納米探針依次裝配到電極表面后，電極表面的HRP可催化3，3'-二甲氧基聯(lián)苯胺（DB）聚合形成PDB絕緣聚合物薄膜。因此，F(xiàn)e（CN）63-/4-溶液中電極的氧化還原電流減小，并且降低的氧化還原電流與檢測到的CEA濃度成比例，實現(xiàn)了對CEA檢測的高靈敏度。降低的電流與CEA在1 pg-10 ng/mL范圍內(nèi)的濃度呈對數(shù)關(guān)系，檢測限為0.5 pg/mL。

3.5 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的其他類型功能核酸生物傳感器

3.5.1 溫度傳感器 大多數(shù)的溫敏材料只有單一的信號響應(yīng)，沒有更好的熒光穩(wěn)定性和對比度。Oemrawsingh和 Zhao等［40-41］的研究為 Ag NCs的熒光受溫度變化的調(diào)控提供了明確的證據(jù)，但熒光Ag NCs對溫度并沒有明顯的線性響應(yīng)。Zhou等［42］首次報道了一種新型的雙熒光溫度敏感型DNA模板化Ag NCs對，成功地指示了活細胞的溫度，并且證明了溫度誘導(dǎo)的熒光響應(yīng)是由于DNA模板的雜交和去雜交引起的Ag NCs對的整合和分離。用兩個富含C的DNA支架合成銀納米簇（A1-NC，A2-NC），由于A1和A2具有互補序列，使A1-NC，A2-NC彼此靠近，從而獲得了對溫度敏感的銀納米簇對（A-NCP）。A-NCP在 640 nm（A-FL640） 和 570 nm（A-FL570）處呈現(xiàn)兩個明亮的發(fā)射帶，而B-NCP在685 nm（B-FL685）和620 nm（B-FL620）處實現(xiàn)熒光峰值。隨著溫度的升高，A-NCP（A-FL570）的熒光發(fā)射增加，A-FL640減少；B-NCP（B-FL685和B-FL620）的熒光發(fā)射同時降低。因此，A-NCP熒光顏色顯示出從橙色到黃色的變化，而B-NCP的熒光顏色從橙色變?yōu)闊o色，實現(xiàn)了對應(yīng)于15-45℃溫度的敏感變化。此外，發(fā)夾型（AH和BH）模板合成的銀納米簇的熒光對溫度也有類似的響應(yīng)效果。

3.5.2 石英晶體微量天平生物傳感器 Zhou等［43］開發(fā)了一種新型石英晶體微量天平（QCM）生物傳感器，以DNA / Ag NCs作為高效信號放大器，實現(xiàn)了對核酸進行高靈敏度和無標(biāo)記的檢測。用探針DNA對QCM進行修飾，使其特異性地捕獲目標(biāo)DNA。然后，將DNA模板化的Ag NCs組裝起來，通過與DNA骨架相連的Ag+增強QCM傳感器的靈敏度，然后氫醌誘導(dǎo)Ag NCs的還原形成。用TEM和AFM進一步證實了DNA模板化Ag NCs的形成。結(jié)果表明，在這種放大模式下，QCM傳感器的頻率響應(yīng)高達87倍。頻率響應(yīng)與DNA濃度在0.6 nmol/L-30 nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.1 nmol/L。

3.5.3 智能邏輯生物傳感器 作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，DNA / Ag NCs優(yōu)于有機染料和量子點，因為DNA /Ag NCs的使用不僅避免了DNA與信號指示劑的共價標(biāo)記，而且更容易被引入DNA邏輯系統(tǒng)［44］。這些內(nèi)在特性賦予DNA / Ag NCs在并行/級聯(lián)邏輯門和計算電路的開發(fā)中具有前景的應(yīng)用。

Zhang等［45］構(gòu)造了基于銀納米團簇（Ag NCs）/氧化石墨烯（GO）的一系列邏輯電路以執(zhí)行非算術(shù)功能，包括3位、4位和5位奇數(shù)/偶數(shù)檢查，由此產(chǎn)生的設(shè)備可以區(qū)分0-31范圍內(nèi)的偶數(shù)和奇數(shù)十進制數(shù)。另外，這些裝置可以在生物基質(zhì)中穩(wěn)定地執(zhí)行它們的邏輯操作，表明基于Ag NCs / GO的系統(tǒng)可以在復(fù)雜的生物環(huán)境中操作。Fan等［44］結(jié)合GO對DNA模板化Ag NCs的猝滅能力和G-四鏈體增強的卟啉染料熒光強度，首次構(gòu)建了無標(biāo)簽、無酶的2-to-1、4-to-2編碼器和1-to-2解碼器。此外，Lin等［46］首次將DNA / Ag NCs的多路復(fù)用器用作智能生物傳感器，以高靈敏度識別大腸桿菌和金黃色葡萄球菌致病基因，在通用平臺上集成多個DNA邏輯門，實現(xiàn)了先進的邏輯功能。該研究簡單易用，為多分子器件的集成和智能診斷提供了一種有指導(dǎo)意義的方法。

4 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器的應(yīng)用

4.1 DNA/銀納米簇用于胞內(nèi)成像

在過去的20年中，具有分子樣能級的少數(shù)原子貴金屬納米團簇已經(jīng)成為具有顯著光電性質(zhì)的新型熒光團［47］。由于DNA / Ag NCs易于合成的途徑，良好的光穩(wěn)定性和生物相容性以及高量子產(chǎn)率的優(yōu)良特性，使其成為許多應(yīng)用的有力候選者，特別是在生物成像方面［48］。

4.1.1 細胞成像 靈敏、特異的腫瘤細胞檢測不僅對腫瘤的早期診斷，而且對腫瘤轉(zhuǎn)移的研究具有重要意義。Ai等［49］利用AS1411為模板來合成銀納米團簇以發(fā)掘其潛在應(yīng)用。在形成銀納米團簇后，AS1411仍然保持其結(jié)構(gòu)并且能夠與癌細胞中的核仁蛋白結(jié)合。同時，這種結(jié)合可以極大地增強銀納米團簇的熒光強度。該性質(zhì)可直接用于HeLa細胞的生物成像。

Li等［50］受到真核細胞核中普遍存在的端粒含有重復(fù)DNA序列TTAGGG的啟發(fā)，基于DNA /Ag NCs在細胞核內(nèi)的原位熒光激活作用，開發(fā)了一種新穎、簡便、無標(biāo)記、特異性和通用的細胞核成像方法。NC-a模板化的Ag NCs和富含G的b序列將通過與DNA探針C-ab互補而聚集在一起。從而使Ag NCs的熒光激活。此外，研究者還根據(jù)端粒的重復(fù)序列TTAGGG設(shè)計了具有不同富含G序列的5個探針。結(jié)果表明，在C-ab存在下，所有五種探針均可作為Ag NCs的有效熒光增強劑，從而進一步驗證了無熒光的Ag NCs可以通過端粒序列激活。然后用CEM細胞作為模型，流式細胞術(shù)測定顯示無熒光的Ag NCs可以快速進入細胞并且在沒有洗滌的簡單孵育后，熒光被強烈激活，實現(xiàn)了原位細胞成像。

Yin等［51］提出了一種基于識別誘導(dǎo)的適配體構(gòu)象改變從而使富含鳥嘌呤的DNA序列靠近DNA /Ag NCs，利用熒光增強效應(yīng)來檢測癌細胞的策略。DNA探針是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由3'端的目標(biāo)特異性適配體序列、富含鳥嘌呤的DNA序列和5'端的臂段（表示為識別探針）組成。另一個作為信號探針，包含一個用于Ag NCs模板合成的序列和一個與識別探針的ARM段互補的鏈接序列。適體與癌細胞的識別和結(jié)合迫使識別探針進行構(gòu)象改變，進而啟動識別探針的臂段與信號探針的連接序列之間的雜交。然后Ag NCs靠近富含G的DNA，從而增強熒光。實驗結(jié)果表明，該策略采用特異性適配體sgc8c能對CCRF-CEM細胞進行特異性成像，在200 μL結(jié)合緩沖液中檢測到低至150個CCRF-CEM細胞。

4.1.2 酶活檢測 Huang等［52］構(gòu)建了一種新型熒光報告基因，可以實現(xiàn)端粒酶活性的檢測。此外，探針成功用于區(qū)分正常細胞和癌細胞，并監(jiān)測用抑制模型藥物治療后的實時端粒酶活性反應(yīng)。低熒光的H-Ag NCs探針設(shè)計含有3個功能性DNA支架（H序列）：Ag NCs的模板序列polyC、T5環(huán)、9個堿基的互補序列。探針中的端粒DNA可以在端粒酶存在的情況下延伸，得到幾個重復(fù)的TTAGGG序列，然后重復(fù)序列與探針中的互補序列雜交形成自發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于富含G序列接近而導(dǎo)致 Ag NCs顯著的熒光增強?；跓晒庠鰪?，可以檢測和成像細胞內(nèi)端粒酶活性。相反，如果細胞中端粒酶活性不足，底物不能延長，則無法觀察到H-Ag NCs探針的熒光。

4.2 DNA/銀納米簇的抑菌作用

一定的時間內(nèi)，銀納米抗菌劑可以使某些細菌、真菌或病毒等微生物的生長繁殖保持在必要水平以下。納米銀可通過3種機制破壞細菌膜：首先，從納米銀中釋放出的Ag+可以在細菌膜中遷移，從而導(dǎo)致細胞死亡；其次，細胞質(zhì)中的巰基或細胞質(zhì)中的磷基團與Ag+之間的相互作用會導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而抑制DNA的復(fù)制能力。最后，細胞膜和銀納米之間的靜電相互作用形成了可作為運輸屏障的壁坑［53-54］，從而使細胞出現(xiàn)功能障礙而死亡。

Yang等［55］首次使用支鏈DNA作為支架來調(diào)節(jié)銀納米團簇（super-Ag NCs）的形成，其空間結(jié)構(gòu)被精確設(shè)計和構(gòu)建。ssDNA的互補黏端的雜交合成分支的DNA / Ag NCs，實現(xiàn)了具有可調(diào)形狀和臂長的超級Ag NCs，包括Y、X和（Y-X）形超級Ag NCs。超級Ag NCs表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，濃度為20 μmol/L的（Y-X）-super-NC可使細菌生長延遲至8 h。超級Ag NCs增強抑菌效果的原因可能是超級NCs提供更高濃度的Ag+并且其分支結(jié)構(gòu)增加了Ag+與細菌接觸以及與細菌表面黏附的機會。

Javani等［56］探討了 DNA / Ag NCs在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中的抗菌特性。在測試了9種具有不同序列和長度的寡核苷酸后發(fā)現(xiàn)，抗菌活性取決于所用寡核苷酸的序列。將Ag NCs按熒光顏色分組為藍色、黃色和紅色發(fā)射體，結(jié)果表明，藍色發(fā)射體產(chǎn)生的抗菌活性較差，而黃色和紅色發(fā)射體則具有與硝酸銀相似的活性。并基于以上發(fā)現(xiàn)制備了三聚體結(jié)構(gòu)，其中含有提供最佳抗菌活性的序列，其可以抑制亞微摩爾范圍內(nèi)革蘭氏陽性和陰性細菌的生長。

5 總結(jié)與展望

本文介紹了基于DNA / Ag NCs開發(fā)的一系列生物傳感器，總結(jié)了其在分析檢測、體內(nèi)成像及抑菌方面的應(yīng)用?？偟膩碚f，DNA / Ag NCs介導(dǎo)的生物傳感器可以檢測生物體內(nèi)特定酶的活性、某一段基因序列、重金屬，真菌毒素等多種靶標(biāo)分子，還可以基于細胞成像進行癌細胞以及酶活的檢測。此外，DNA / Ag NCs的形狀以及DNA模板序列對其抑菌作用都有影響。

目前對于DNA / Ag NCs生物傳感器的研究仍處于探索階段，如何有效的控制DNA / Ag NCs核的生長速率，提高材料的性能還需要繼續(xù)研究?，F(xiàn)有的研究在DNA / Ag NCs熒光的轉(zhuǎn)變以及增強的機制還不夠清晰，對DNA / Ag NCs的形貌調(diào)控和納米尺寸上的排布還不夠精準(zhǔn)。另外，盡管銀納米簇具有許多優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，如尺寸小，水溶性好，耐漂白性能強和生物毒性小等，但穩(wěn)定性仍是限制其應(yīng)用的主要因素之一，因此，合成穩(wěn)定的銀納米簇也是未來研究工作中的重要課題之一。

雖然DNA / Ag NCs生物傳感器已經(jīng)拓展出成百上千種應(yīng)用，但衍生出的檢測方法主要基于對DNA模板的精巧設(shè)計，未來可在其他方面進一步探究。如與新型納米材料、復(fù)合納米材料等結(jié)合，賦予DNA / Ag NCs更多優(yōu)良的性質(zhì)并研究其雜化規(guī)律，建立新的傳感方法。

DNA / Ag NCs在生物成像方面的應(yīng)用仍處于起步階段，在未來的研究中可以用其來感測細胞內(nèi)活性物質(zhì)如三磷酸腺苷（ATP）等。此外，還可以進一步利用其成像特性來進行藥物篩選以及藥物的定向投遞，拓展其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

為了提高Ag NCs的抗菌效率，可以通過將Ag NCs與商品化抗生素結(jié)合來開發(fā)有效的抗菌材料。另外，Ag NCs的一個獨特特性是它們顯示出強發(fā)光性。這可以促進可追溯抗菌劑的開發(fā)，除了監(jiān)視它們與細菌細胞壁的相互作用外，發(fā)光信號還可以用于檢測其細胞內(nèi)的積累。最后，還可以借助Ag NCs的發(fā)光來研究抗菌機理。銀屬于重金屬，對細胞有與一定的毒害作用。在臨床實驗中，準(zhǔn)確了解Ag+的釋放量，可以最大程度地減少基于Ag的抗菌劑可能引起的細胞毒性，還需要對DNA / Ag NCs進行更加深入的研究，解決這些細節(jié)問題。