卓 麗，許 敏，鄧浩輝

阿舒瑞韋(ASV)聯(lián)合達拉他韋(DCV)治療慢性丙型肝炎(CHC)方案于2017年在中國獲得批準上市，主要適用于丙型肝炎病毒(HCV) 1b基因型感染的CHC和代償期丙型肝炎肝硬化患者，在上市前的臨床試驗和目前的臨床應(yīng)用報道顯示出良好的安全性和臨床療效[1,2]。目前，包括ASV聯(lián)合DCV在內(nèi)的直接抗病毒藥物(DAAs)治療方案仍未達到100%持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，部分患者經(jīng)DAAs治療后仍有病情復(fù)發(fā)現(xiàn)象[1,3]。本研究應(yīng)用ASV聯(lián)合DCV治療CHC患者，觀察了臨床療效情況，并對其中1例停藥后病情復(fù)發(fā)患者基線和復(fù)發(fā)時HCV準種特征進行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2017年10月～2019年6月廣州市第八人民醫(yī)院門診就診的HCV 1b基因型感染的CHC患者40例，其中CHC和代償期丙型肝炎肝硬化患者分別為27例和13例，α-干擾素經(jīng)治或初治患者分別為15例和25例。納入的患者符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和感染病學(xué)分會發(fā)布的《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準[4]。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)廣州市第八人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

(3)變異操作 采用單點變異策略對機器選擇鏈進行變異操作，隨機選擇一道工序，改變該工序的當(dāng)前加工機器。采用互換變異策略對工序順序鏈進行變異操作，如圖7所示，隨機選擇不同位置兩道工序，互換其基因值。

1.2 治療方法 給予所有患者ASV(百時施貴寶)100 mg口服，2次/d，DCV(百時施貴寶)60 mg口服，1次/d，治療24 w。在治療結(jié)束后繼續(xù)隨訪12 w。

1.3 血清HCV耐藥變異和準種分析 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，德國)病毒核酸提取試劑盒提取血RNA，使用HCV 1b基因型特異引物(5′-CTACCCCTACRGAAAGTAGGAGTAGGCA-3′，nt9324-nt9351，HCV H77，NC_004102)和PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行HCV RNA逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)HCV 1b基因型保守區(qū)設(shè)計引物(表1)，并在引物5’端隨機加入6個已知序列堿基(用于數(shù)據(jù)分析階段各混樣基因片段的數(shù)據(jù)分離)，擴增血清包含NS3蛋白酶抑制劑和NS5A聚合酶抑制劑耐藥位點的基因片段。另在治療失敗患者治療前和復(fù)發(fā)時取血，擴增血清HCV的主要功能區(qū)域(Core、E1、E2、NS2、NS3、NS4、NS5A和NS5B)的部分基因(因二代測序讀長的限制，設(shè)計每個片段擴增長度均小于500 bp，具體引物序列可向通訊作者索取)。使用巢式PCR和PrimeStar高保真酶(Takara，大連)擴增HCV各基因片段，對PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen，德國)膠回收試劑盒行PCR產(chǎn)物回收，使用Nanodrop2000核酸定量儀進行核酸定量。取每個樣本DNA 20 ng進行混樣，統(tǒng)一進行DNA文庫的構(gòu)建，在數(shù)據(jù)分析階段進行數(shù)據(jù)分離。對上述混樣的DNA基因產(chǎn)物，使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美國)行DNA文庫的構(gòu)建。對已構(gòu)建的DNA文庫送北京諾禾致源公司測序(Hiseq平臺，PE250模式)。對二代測序錯誤率的估計：本研究在耐藥變異的二代測序過程中，由于存在HCV RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR和測序等實驗過程，均可引物堿基錯誤，故設(shè)立標(biāo)準，評估整個體系中引入的錯誤率。根據(jù)我們課題組前期研究設(shè)立的質(zhì)粒檢測過程中引物的堿基錯誤率和文獻報道[5-7]，定義1%以上的變異為陽性。ASV和DCV耐藥相關(guān)變異的定義：參考文獻[8-10]，ASV相關(guān)耐藥變異(NS3)為：V36L、Q80K、S122N/R/T、D168A/H；DCV耐藥相關(guān)變異(NS5A)為：L31M/F/V和Y93C/H/N。二代測序數(shù)據(jù)的處理：應(yīng)用FASTX-Toolkits軟件進行數(shù)據(jù)過濾，剔除Q30小于90%的序列。應(yīng)用Flash v1.2.7軟件進行序列的拼接。然后，應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件進行數(shù)據(jù)進一步過濾與分析，剔除大于或小于預(yù)期片段長度的序列。應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件，并以1%陽性截斷點確定ASV和DCV耐藥變異。應(yīng)用香農(nóng)熵指數(shù)(Sn)描述HCV準種多復(fù)雜度。使用遺傳距離(d)、非同義突變率(dN)和同義突變率(dS)三個參數(shù)描述多樣性[11,12]，并應(yīng)用Tajima中性檢驗對治療前和復(fù)發(fā)樣本核酸分子進化特征分析。應(yīng)用R語言Vegan包計算Sn，應(yīng)用Mega7.0軟件計算d、dN、dS和Tajima中性檢驗。最后，應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件對復(fù)發(fā)樣本核酸序列與治療前核酸序列進行多序列比對，計算其同源性。

2.3 復(fù)發(fā)患者耐藥變異和病毒準種變化特征分析 1例治療失敗的CHC患者為49歲男性，有輸血和接受性服務(wù)史，基線血清HCV RNA為1.08×107IU/ml, ALT為74 U/L，B超未提示異常，肝臟硬度為5.9 Kpa，經(jīng)ASV聯(lián)合DCV治療24 w，血清HCV RNA陰性，ALT為39 U/L，停藥12周時血清HCV RNA為3.58×105IU/ml，ALT為76U/L。對基線和復(fù)發(fā)時血清核酸序列進行同源性檢測，結(jié)果提示復(fù)發(fā)與基線血清各基因片段一致性序列為19.9%～45.2%之間，排除重新感染，考慮為復(fù)發(fā)(表2)。

2 結(jié)果

同源性計算方法為復(fù)發(fā)血清HCV核酸序列與基線血清核酸序列的多序列比對，一致性的序列定義為同源性序列2.4 基線與復(fù)發(fā)血清病毒耐藥變異和準種變化特征分析 我們對上述1例CHC患者基線和復(fù)發(fā)時病毒NS3蛋白酶抑制劑和NS5A抑制劑相關(guān)耐藥變異進行了分析，結(jié)果提示在基線和復(fù)發(fā)時血清中，均未發(fā)現(xiàn)NS3蛋白酶抑制劑相關(guān)的耐藥變異，但在基線時，存在L31V+Y93H的NS5A聚合酶抑制劑相關(guān)耐藥變異，耐藥變異頻率分別為2.1%和56.2%，復(fù)發(fā)時也存在L31V+Y93H耐藥變異，但變異頻率均為100.0%。對HCV各基因片段準種多樣性和復(fù)雜度的差異比較，結(jié)果提示在HCV基因組的主要區(qū)域基線準種復(fù)雜度均顯著高于復(fù)發(fā)時血清。另外，我們對基線和復(fù)發(fā)時血清各HCV基因片段進行Tajima中性檢驗，結(jié)果提示基線各HCV基因片段序列的D值顯著高于復(fù)發(fā)時(表3)。

《史記·太史公自序》明確說“太史公(司馬談)仕于建元、元封之間”，即司馬談為官的時間是在“建元”至“元封”之間?！敖ㄔ?、“元封”均為漢武帝時年號，其間包括“元光”、“元朔”、“元狩”、“元鼎”等年號，時間跨度從公元前140年至前105年。“建元”共有六年，至于司馬談為官始于“建元”哪一年，司馬遷雖然沒有明載，但上限可確定為“建元元年”至“建元六年”，即前140—前135年的六年之間。

表1 引物序列

HCV NS3基因擴增的位置為：nt3518～3929；HCV NS5A擴增的位置為：nt 6349～6602，核酸位置基于HCV參考序列H77，NC-004102

厚靶通常是指靶板的厚度大大超過碰撞產(chǎn)生的坑深。小行星撞擊地球形成隕石坑就是典型的超高速彈丸對厚靶(半無限厚靶)的侵徹現(xiàn)象，如圖1所示。

2.2 ASV聯(lián)合DCV治療的臨床療效和安全性 在本組40例患者中，38例(95.0%)在隨訪12周時獲得SVR，2例(5.0%)未獲得SVR；92.6%(25/27)CHC患者獲得SVR，100.0%(13/13)代償期丙型肝炎肝硬化均獲得SVR；93.3%(14/15)α-干擾素經(jīng)治和96.0%(24/25)初治的患者獲得SVR。治療失敗的2例患者均存在NS5A抑制劑相關(guān)的耐藥變異，其中1例為L31V+Y93H變異，另一例為Y93H耐藥變異。在治療過程中，有7例(17.5%)患者出現(xiàn)不良事件，其中2例(5.0%)血清ALT升高，2例(5.0%)出現(xiàn)血小板下降，1例(2.5%)血紅蛋白下降，2例(5.0%)血尿酸升高。上述不良事件均在治療過程中或治療結(jié)束后恢復(fù)正常，未導(dǎo)致患者停藥。

表2 1例復(fù)發(fā)患者基線與復(fù)發(fā)時血清HCV基因片段同源序列分析

2.1 一般資料 在本組40例患者中，男性23例，女性17例；中位年齡為39(28，53)歲；病毒載量為6.3±0.8 lgIU/ml；15例(37.5%)為α-干擾素經(jīng)治患者；10例(25.0%)患者基線谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平大于正常值上限；1例(2.5%)存在NS3蛋白酶抑制劑(ASV)相關(guān)的D168E基線耐藥變異，1例(2.5%)存在NS5A聚合酶抑制劑(DCV)相關(guān)的L31M耐藥變異，1例(2.5%)存在L31V/Y93H耐藥變異，另2例(5.0%)存在Y93H耐藥變異。

表3 基線與復(fù)發(fā)時血清HCV基因片段準種復(fù)雜度、多樣性和Tajima中性檢驗差異比較

Sn、d、dN和dS的單位均為10-3變異/位點，基線血清HCV準種復(fù)雜度(Sn)、多樣性(d、dN和dS)和Tajima中性檢驗的D值(配對t檢驗)均顯著高于復(fù)發(fā)血清(P<0.05)

3 討論

ASV聯(lián)合DCV方案是在2017年在中國獲批準上市，是國內(nèi)首個上市的DAA藥物，主要適用于HCV 1b基因型感染的CHC患者[4, 13]，該方案在上市前的臨床試驗和真實世界的研究均顯示出良好的療效和安全性[1,2,14]。

相比器官移植醫(yī)學(xué)實踐，我國器官移植立法起步較晚。2003年《深圳經(jīng)濟特區(qū)器官捐獻移植條例》頒布，這是我國首部器官移植地方性法規(guī)。2006年衛(wèi)生部制定《人體器官移植技術(shù)臨床應(yīng)用管理暫行規(guī)定》，2007年國務(wù)院通過《人體器官移植條例》，“任何組織或者個人不得以任何形式買賣人體器官，不得從事與買賣人體器官有關(guān)的活動”。關(guān)于器官移植可能承擔(dān)的法律責(zé)任，除規(guī)定行政和民事責(zé)任外，還指出，違反本條例規(guī)定，有下列情形之一，構(gòu)成犯罪的，依法追究刑事責(zé)任:未經(jīng)公民本人同意摘取其活體器官的;公民生前表示不同意捐獻其人體器官而摘取其尸體器官的;摘取未滿18周歲公民的活體器官的。

本研究在小樣本的短期觀察發(fā)現(xiàn)該方案治療CHC和丙型肝炎肝硬化患者療效好，只有少數(shù)患者治療失敗，可能與存在DCV相關(guān)的L31V+Y93H耐藥變異或Y93H耐藥變異有關(guān)，提示存在基線NS5A抑制劑相關(guān)耐藥變異者應(yīng)避免選擇ASV聯(lián)合DCV治療方案。

準種分析提示復(fù)發(fā)血清各HCV基因片段的準種復(fù)雜度和多樣性顯著低于基線血清，而Tajima中性檢驗提示復(fù)發(fā)血清D值顯著小于0并小于基線血清，提示ASV聯(lián)合DCV治療方案對該例病情復(fù)發(fā)患者體內(nèi)存在的L31V+Y93H耐藥變異毒株敏感性差，有關(guān)研究還需擴大進行。