廖揚(yáng)靜 關(guān)衛(wèi)兵 張炯善 肖閣敏 楊宏志

【摘要】目的 探討突觸融合蛋白6（STX6）表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌（肝癌）患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，評(píng)估STX6在肝癌預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。方法 通過(guò)TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得371例肝癌組織和肝癌旁組織STX6的表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料，分析STX6在肝癌組織及肝癌旁組織中的表達(dá)差異及對(duì)肝癌患者的預(yù)后影響。使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)58例肝癌患者的新鮮冷凍腫瘤組織樣本及肝癌旁組織的STX6 mRNA表達(dá)水平。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)8例肝癌患者的腫瘤組織和肝癌旁組織、正常肝細(xì)胞LO2和7種人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞STX6蛋白表達(dá)差異，免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）法觀察肝癌患者的腫瘤組織和肝癌旁組織STX6蛋白染色差異，根據(jù)STX6 mRNA表達(dá)水平分為STX6低表達(dá)組與STX6高表達(dá)組，分析肝癌患者STX6 mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)和肝癌生存預(yù)后的關(guān)系，并建立Cox回歸模型判斷STX6對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片及臨床數(shù)據(jù)分析顯示，371例肝癌組織的STX6 mRNA表達(dá)水平高于肝癌旁組織（P < 0.001），并且肝癌組織STX6 mRNA表達(dá)水平隨腫瘤臨床分期（Ⅰ ～ Ⅲ期）及病理分期（G1 ～ G3期）升高而升高（總體及組間兩兩比較P均< 0.05），STX6高表達(dá)組肝癌患者總生存率低于STX6低表達(dá)組（P < 0.05）。58例肝癌組織中STX6 mRNA表達(dá)水平高于肝癌旁組織（P < 0.05）。進(jìn)一步分析顯示，STX6高表達(dá)者的腫瘤分化程度較低、腫瘤較大、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期較高（P均< 0.05）。蛋白免疫印跡顯示，肝癌組織中STX6蛋白表達(dá)較肝癌旁組織升高（8例標(biāo)本中有6例提示高表達(dá)）。7種不同肝癌細(xì)胞系細(xì)胞中的STX6蛋白表達(dá)均較人正常肝細(xì)胞升高。免疫組化也顯示STX6在肝癌組織中的表達(dá)高于肝癌旁組織，并且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。STX6高表達(dá)組肝癌患者的整體生存率低于低表達(dá)組（P = 0.039）。Cox回歸分析顯示，AJCC腫瘤分期（HR = 5.454，95%CI 1.825 ～ 16.297，P = 0.002）和STX6 mRNA表達(dá)水平（HR = 3.872，95%CI 1.641 ～ 9.140，P = 0.002）與肝癌術(shù)后總生存率密切相關(guān)。結(jié)論 STX6水平可以作為評(píng)估肝癌的預(yù)后分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】突觸融合蛋白6;肝細(xì)胞癌;預(yù)后

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression of syntaxin 6 （STX6） and clinicopathological parameters of patients with hepatocellular carcinoma （HCC）， aiming to evaluate the value of STX6 in predicting the clinical prognosis of these patients. Methods The STX6 expression level and clinical data of 371 HCC patients and matched tissues surrounding hepatoma were obtained from TCGA public database. The STX6 expression levels between HCC and tissues surrounding hepatoma were analyzed and its prognostic value for HCC patients was evaluated. Next， the expression levels of STX6 mRNA in the fresh frozen HCC tissues and tissues surrounding hepatoma from 58 HCC patients were quantitatively detected by real-time quantitative PCR. The expression levels of STX6 protein in the HCC and tissues surrounding hepatoma from 8 HCC patients， normal liver cell LO2 and 7 types of human liver cancer cell lines were detected by Western blot. The staining of STX6 protein in the HCC and tissues surrounding hepatoma was assessed by immunohistochemistry. All patients were divided into STX6 low-and high-expression groups according to the expression of STX6 mRNA. The relationship between STX6 mRNA expression and clinicopathological parameters and clinical prognosis of HCC was analyzed. Finally， a Coxs regression model was established to determine whether STX6 could be used as an independent factor affecting the clinical prognosis of HCC patients. Results TCGA database demonstrated that the expression levels of STX6 mRNA in the HCC tissues were significantly higher compared with those in the tissues surrounding hepatoma （all P < 0.001）. The expression level of STX6 mRNA was significantly up-regulated along with the clinical staging （stage Ⅰ-Ⅲ） and pathological staging （stage G1-G3） （all P < 0.05）. The overall survival （OS） of patients with higher STX6 expression was significantly shorter compared with their counterparts with lower STX6 expression （P < 0.05）. The expression level of STX6 mRNA in the HCC tissues was significantly higher than that in the tissues surrounding hepatoma （P < 0.05）. Patients with higher STX6 expression presented with lower tumor differentiation grade， larger tumor size and higher AJCC cancer staging （all P < 0.05）. Western blot showed that the expression of STX6 protein in the HCC tissues was up-regulated than that in the tissues surrounding hepatoma （6 of 8 cases with high expression）. The expression levels of STX6 protein in 7 types of human liver cancer cell lines were up-regulated than that in hepatocyte line LO2. Immunohistochemistry indicated that the expression of STX6 in the HCC tissues was higher than that in tissues surrounding hepatoma， primarily expressed in the cytoplasm. The OS of HCC patients with higher STX6 expression was remarkably shorter than that of those with lower STX6 expression （P = 0.039）. Coxs regression analysis showed that AJCC cancer staging （HR = 5.454， 95%CI 1.825-16.297， P = 0.002） and expression of STX6 mRNA （HR = 3.872， 95%CI 1.641-9.140， P = 0.002） were significantly correlated with postoperative OS of HCC patients. Conclusion STX6 expression level can serve as an independent prognostic factor for HCC patients.

【Key words】Syntaxin 6;Hepatocellular carcinoma;Prognosis

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝細(xì)胞癌（肝癌）是2018年全球第六大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是世界上第四致命的惡性腫瘤[1]。在2015年，中國(guó)大約有466 100例新的肝癌病例發(fā)生，死亡病例約達(dá)422 100例[2]。盡管外科手術(shù)技術(shù)和綜合治療方法不斷改進(jìn)，但肝癌的預(yù)后仍不盡如人意。近年來(lái)，肝癌分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用加深了我們對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。但是，目前尚沒(méi)有顯著有效的生物標(biāo)志物用于肝癌分子靶向治療。突觸融合蛋白6（STX6）是可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺-敏感因子附著蛋白受體（SNARE）蛋白家族的一員，可通過(guò)參與多種腫瘤相關(guān)蛋白的囊泡運(yùn)輸，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前已有多項(xiàng)研究顯示STX6在腎細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）等多種腫瘤組織中明顯高表達(dá)，STX6已被證實(shí)為潛在的致癌基因。然而STX6與肝癌的關(guān)系尚未有相關(guān)研究報(bào)道，為此，本研究分析STX6在肝癌組織和細(xì)胞中的蛋白及mRNA表達(dá)水平，探討STX6的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，評(píng)估STX6在肝癌預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

58例肝癌組織和癌旁正常肝組織標(biāo)本來(lái)源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2003年1月至2007年12月行肝癌手術(shù)切除術(shù)的患者，其中男53例、女5例，年齡（52±9）歲，隨訪時(shí)間2個(gè)月 ～ 9年?；颊叩氖中g(shù)日期至最后隨訪時(shí)間或死亡時(shí)間的時(shí)間長(zhǎng)度作為患者的生存時(shí)間。

二、肝癌大樣本數(shù)據(jù)的獲取

通過(guò)美國(guó)腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載371例肝細(xì)胞癌患者STX6表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料，并比較該大樣本數(shù)據(jù)中腫瘤組織和肝癌旁組織STX6 mRNA表達(dá)水平，分析STX6轉(zhuǎn)錄水平與臨床病理特征的相關(guān)性。最后以STX6 mRNA表達(dá)量的中位值將肝癌患者分為STX6高表達(dá)組和STX6低表達(dá)組，分析STX6對(duì)肝癌患者的預(yù)后價(jià)值。

三、 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

研究中所用到的細(xì)胞系包括人正常肝細(xì)胞LO2，人肝癌細(xì)胞系[HepG2（G2）、Huh7（Huh）、Hep3B（3B）、Bel7404（7404）、MHCC97H（97H）、SMMC7721（7721）、QGY7703（QGY）]，均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，LO2細(xì)胞和其他人肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)分別使用Gibco?RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（Invitrogen公司），添加10%胎牛血清（Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素（Invitrogen公司），于37℃、5%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在80%～90%融合后傳代培養(yǎng)。

四、蛋白免疫印跡法

本研究使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)了8例肝癌患者中腫瘤組織和肝癌旁組織STX6表達(dá)差異，操作如下：①蛋白提取按照全蛋白提取試劑盒（KGP250;凱基生物）說(shuō)明書進(jìn)行肝癌組織和肝癌細(xì)胞的蛋白提取。并采用BCA試劑盒（BCA-23225;凱基生物）測(cè)定蛋白濃度，蛋白放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?②電泳采用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（KGP113;凱基生物）制備10%的分離膠和濃縮膠，上樣待測(cè)樣品和分子量標(biāo)志物Marker，先在60 ～ 90 V電壓下電泳至分離膠，改換120 V電壓下至電泳結(jié)束;③轉(zhuǎn)膜，恒流300 mA條件下，轉(zhuǎn)膜1.5 h;④檢測(cè)目的蛋白，采用磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜3次后，孵育STX6抗體（ab140607;Abcam公司）置于4 ℃環(huán)境過(guò)夜。洗膜3次，室溫下孵育二抗（KGAA35;凱基生物）1 h。洗膜3次，于暗室進(jìn)行曝光顯影，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）

按照Dako免疫組化試劑盒（K5007;Dako）說(shuō)明書中步驟進(jìn)行STX6染色，在顯微鏡下觀察肝癌組織和肝癌旁組織的染色結(jié)果差異。

六、實(shí)時(shí)定量PCR

使用RNA快速提取試劑盒（RN001;奕杉生物）提取58例新鮮冷凍肝癌組織樣本及肝癌旁組織樣本的總RNA，并使用Roche Tra-nscriptor cDNA Synth.Kit2逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述RNA逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA。β-actin作為對(duì)照管家基因。引物如下：STX6上游5-AGAGCAAGAGGGTTCTGCATTG-3，下游5-TGGTACAGCAACATCAAGTCGG-3，β-actin上游5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3，下游5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3。Roche SYBR Green試劑作為通用染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。冰上避光用96孔板配制PCR反應(yīng)體系（總體積10 μl）：DEPC水3 μl，SYBR Green I Master 5 μl，STX 6及β-actin上游引物各0.5 μl、下游引物各0.5 μl。將96孔板于Roche LightCycler? 480 PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)置程序?yàn)椋?95℃ 5 min，然后95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s循環(huán)40次，最后95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃ 5 min、40℃ 10 s。采用2-△△Ct方法分析組織樣本間STX6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式：2-△△Ct，△Ct = CtSTX6-Ctβ-actin。以STX6 mRNA表達(dá)量的中位值，將肝癌患者分為STX6高表達(dá)組和STX6低表達(dá)組。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，肝癌組織及肝癌旁組織的表達(dá)差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)，低表達(dá)組與高表達(dá)組的比較采用成組t檢驗(yàn)，不同臨床分期及病理分期間的表達(dá)差異采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)量資料以例（%）表示，無(wú)序分類資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;等級(jí)資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。構(gòu)建Kaplan-Meier生存分析模型評(píng)估STX6高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存率，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)，最后通過(guò)Cox回歸分析肝癌患者預(yù)后的影響因素，其中多因素回歸分析采用Forward LR法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片及臨床數(shù)據(jù)分析

371例肝癌的STX6 mRNA表達(dá)水平高于肝癌旁組織（P < 0.001），并且肝癌患者STX6 mRNA表達(dá)水平隨腫瘤臨床分期（Ⅰ ～ Ⅲ期）及病理分期（G1 ～ G3期）升高而升高（總體及組間兩兩比較P均< 0.05），肝癌患者STX6 mRNA表達(dá)水平在腫瘤臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期及病理分期G3期和G4期間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。以STX6 mRNA表達(dá)水平的中位值為臨界值，將肝癌患者分為STX6高表達(dá)組和STX6低表達(dá)組，Kaplan-Meier分析顯示，STX6 mRNA高表達(dá)組肝癌患者總生存率低于STX6 mRNA低表達(dá)組（P = 0.012），見(jiàn)圖1。

二、肝癌組織和肝癌旁組織分析結(jié)果

58例肝癌組織中STX6 mRNA表達(dá)水平高于肝癌旁組織（P = 0.001），見(jiàn)圖1A。進(jìn)一步分析顯示，STX6高表達(dá)組的腫瘤分化程度較低、腫瘤較大、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期較高（P 均< 0.05），見(jiàn)表1。蛋白免疫印跡顯示，肝癌組織中STX6蛋白表達(dá)較肝癌旁組織升高（8例標(biāo)本中有6例提示高表達(dá)），見(jiàn)圖2B;在7種不同肝癌細(xì)胞系細(xì)胞中的STX6蛋白表達(dá)均較人正常肝細(xì)胞（LO2）升高，見(jiàn)圖2C。免疫組化也顯示STX6在肝癌組織中的表達(dá)高于肝癌旁組織，并且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，見(jiàn)圖2D。以STX6免疫組化結(jié)果將58例患者分為STX6高表達(dá)組和STX6低表達(dá)組，通過(guò)Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，結(jié)果顯示STX6高表達(dá)組肝癌患者的整體生存率低于低表達(dá)組（P = 0.039），見(jiàn)圖2E。

三、STX6的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)

單因素Cox回歸分析顯示，肝癌切除術(shù)后總生存率的影響因素包括腫瘤分化程度、腫瘤大小、AJCC腫瘤分期以及STX6 mRNA表達(dá)水平（P均< 0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，AJCC腫瘤分期（HR = 5.454，95%CI 1.825 ～ 16.297，P = 0.002）和STX6 mRNA表達(dá)水平（HR = 3.872，95%CI 1.641 ～ 9.140，P ?= 0.002）與肝癌術(shù)后總生存率密切相關(guān)，見(jiàn)表2。

討論

2018年全球新增原發(fā)性肝癌高達(dá)841 000例[1]。我國(guó)原發(fā)性肝癌新增病例達(dá)全球新增病例半數(shù)以上。肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管在預(yù)防、診斷和治療方面都取得了進(jìn)步，但發(fā)病率和病死率仍在繼續(xù)上升[3]。大多數(shù)肝癌患者的早期臨床表現(xiàn)不明顯，確診時(shí)間較晚，且通過(guò)手術(shù)治療效果不佳，復(fù)發(fā)率較高。肝移植雖然是有效的治療手段，但國(guó)內(nèi)供體缺乏，所以目前肝癌的治療效果仍不盡如人意[4-5]。免疫治療為肝癌治療提供了新的方向，但目前相關(guān)臨床試驗(yàn)有限且存在并發(fā)癥，其療效有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證[6]。因此，深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，探究新的肝癌分子標(biāo)志物以提高肝癌的診治水平顯得尤為重要。

可溶性NSF附著蛋白受體（SNARE）是參與囊泡運(yùn)輸?shù)囊活惸さ鞍祝谀遗葸\(yùn)輸過(guò)程中，SNARE復(fù)合物可以將囊泡和靶區(qū)室膜錨定在一起，從而促進(jìn)囊泡和靶膜融合[7-8]。STX6是SNARE蛋白家族的一員，主要存在于反式高爾基體膜上，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，如內(nèi)吞作用、循環(huán)、順行和逆行轉(zhuǎn)運(yùn)[9-10]。例如，STX6可參與整合素的傳遞和整合素引發(fā)的黏附斑激酶的激活[11]。整合素屬于細(xì)胞黏附受體，它可作為信號(hào)分子、細(xì)胞機(jī)械傳感器和細(xì)胞遷移中的關(guān)鍵分子，參與惡性腫瘤從原發(fā)到侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程[12-14]。有研究顯示，STX6可作為p53家族（p53、p63和p73）潛在的靶點(diǎn)，是p53家族調(diào)控細(xì)胞黏附和細(xì)胞存活的效應(yīng)體。STX6敲低后可抑制細(xì)胞黏附，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，而且下調(diào)p53表達(dá)可以減弱STX6敲低后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）增殖的抑制效果[15]。此外，有報(bào)道抑制STX6功能可干擾血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）向質(zhì)膜的運(yùn)輸，并促進(jìn)了VEGFR2在溶酶體降解，從而減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和血管形成[16]?？梢?jiàn)STX6在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要角色。

目前已有相關(guān)研究表明STX6與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。Du等[17]的研究顯示，STX6在食管癌組織中高表達(dá)，沉默食管癌細(xì)胞STX6表達(dá)可通過(guò)p53依賴的方式抑制食管癌細(xì)胞的存活和增殖，并且通過(guò)抑制整合素的運(yùn)輸進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的遷移。在腎細(xì)胞癌中STX6蛋白表達(dá)明顯升高，且沉默STX6后腎癌ACHN細(xì)胞活力降低[18]。此外，有研究顯示STX6可調(diào)控化學(xué)治療耐藥相關(guān)分子的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，在前列腺癌耐恩雜魯胺細(xì)胞株（C4‐2B）中STX6以及外泌體高表達(dá)，敲低STX6后前列腺癌細(xì)胞外泌體分泌下降，并且增加了前列腺癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的敏感度，提高前列腺癌的化學(xué)治療效果[19]。在人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780細(xì)胞中，STX6和囊泡相關(guān)膜蛋白4與P型ATP酶膜蛋白共定位，有助順鉑從高爾基體到質(zhì)膜的分泌性囊泡運(yùn)輸，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[20]。因此，STX6可受關(guān)鍵癌基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)分子的胞內(nèi)運(yùn)輸，以及通過(guò)介導(dǎo)胞外泌體分泌促進(jìn)耐藥而參與疾病的進(jìn)展。本研究中，STX6在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系細(xì)胞中高表達(dá)，并且高表達(dá)STX6患者的預(yù)后較低表達(dá)STX6患者差，STX6不僅與肝癌患者臨床病理參數(shù)（例如腫瘤大小、AJCC臨床分期、腫瘤分化程度）等密切相關(guān)，還與肝癌患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-15）

（本文編輯：林燕薇）