施飛熊 張桂蝦 周宇

【摘要】潰瘍性結(jié)腸炎（UC）致病機(jī)制尚未明確，可能與遺傳、免疫及環(huán)境等多種因素有關(guān)。DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并在發(fā)育、分化和基因組穩(wěn)定性中起重要作用。DNA異常甲基化既是腸道慢性炎癥的一個(gè)結(jié)果，同時(shí)也可能在UC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。該文對(duì)DNA異常甲基化在UC中可能存在的機(jī)制及其臨床意義等方面進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎;DNA甲基化;腸道慢性炎癥

【Abstract】The pathogenesis of ulcerative colitis （UC） remains elusive， which is probably correlated with multiple factors， such as heredity， immunity and environment， etc. DNA methylation plays an important role in regulating gene transcription， development， differentiation and genomic stability. Aberrant DNA methylation is not only a consequence of chronic intestinal inflammation， but also may play a role in the occurrence and development of UC. In this article， the possible mechanism and clinical significance of aberrant DNA methylation in UC were reviewed.

【Key words】Ulcerative colits;DNA methylation;Chronic intestinal inflammation

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性腸道炎癥性疾病，其在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，然而其發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，治療效果欠佳。DNA甲基化在調(diào)控正常細(xì)胞過程的基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。近來越來越多研究表明異常DNA甲基化與UC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。有些基因的甲基化程度與UC的非典型增生甚至與UC相關(guān)結(jié)腸癌有關(guān)，而另一些基因在UC與其他疾病中甲基化程度差異較大甚至僅在UC中發(fā)生異常甲基化。因此明確UC中發(fā)生的DNA異常甲基化對(duì)UC的診斷、治療及預(yù)防等方面具有重要意義。本文主要討論了DNA異常甲基化與UC的關(guān)系、DNA甲基化在UC作用的可能機(jī)制及臨床意義。研究UC中DNA異常甲基化有望為UC提供新的血清學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

一、DNA甲基化的功能與作用

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，可能受飲食、疾病和吸煙等環(huán)境因素影響。DNA甲基化有建立（從頭DNA甲基化）、維持和去甲基化等3個(gè)階段，可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并在發(fā)育、分化和基因組穩(wěn)定性中起作用。DNA甲基化在哺乳動(dòng)物基因組中普遍存在，盡管存在一些組織特異性差異，但哺乳動(dòng)物基因組70% ～ 80%的CpG發(fā)生甲基化[1]。甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行，在此過程中，甲基被共價(jià)加到胞嘧啶上，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶。在哺乳動(dòng)物中，DNA主要在CpG二核苷酸處發(fā)生甲基化。CpG島（CGI）是相對(duì)較小的基因組區(qū)域，平均約為1 Kb，通常存在于組成型表達(dá)基因和組織特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域中。除CGI外，哺乳動(dòng)物的基因組通常是低CpG的。超過三分之二的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是CGI，并且?guī)缀跛械墓芗一蚨加蠧GI啟動(dòng)子。

DNA甲基化和基因沉默之間的相關(guān)性與啟動(dòng)子CpG二核苷酸密度成正比。然而其具體轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子易接近的染色質(zhì)區(qū)域通常存在低甲基化或未甲基化，而單個(gè)低甲基化區(qū)域可作為增強(qiáng)子，增加啟動(dòng)子的活性，代表活躍的調(diào)節(jié)區(qū)。此外，轉(zhuǎn)錄因子在未甲基化和低甲基化區(qū)域皆表現(xiàn)富集情況。上述證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合與DNA甲基化互斥，故DNA甲基化可能通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制[2]。但是甲基化的DNA基序也可能為其他轉(zhuǎn)錄因子創(chuàng)造新的結(jié)合位點(diǎn)，被特異性識(shí)別而起作用。例如DNA甲基化可以通過含有甲基CpG結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄抑制因子來讀取。還有，DNA甲基化序列也可以被轉(zhuǎn)錄激活因子特異性識(shí)別。研究發(fā)現(xiàn)，人類和小鼠表達(dá)數(shù)十種具有特定甲基化序列結(jié)合偏好的轉(zhuǎn)錄因子，許多轉(zhuǎn)錄因子更易與CpG甲基化序列結(jié)合，其中大多數(shù)在擴(kuò)展的同源結(jié)構(gòu)域家族中[3]。DNA甲基化作為一種控制基因表達(dá)的手段具有至關(guān)重要的作用。例如DNA甲基化在X染色體失活中起關(guān)鍵作用。在雌性哺乳動(dòng)物的發(fā)育過程中，每個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)活性X染色體被非編碼RNA X非活性特異轉(zhuǎn)錄物（XIST）隨機(jī)沉默。X連鎖的CGI發(fā)生甲基化相對(duì)較晚，并且在基因已經(jīng)沉默之后起到最終鎖定的作用，最終導(dǎo)致X染色體失活[4]。此外，異常DNA甲基化是許多疾病的特征，包括各種類型的癌癥及炎癥性疾病，異常的啟動(dòng)子CGI甲基化正成為疾病檢測(cè)、診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[5]。

二、DNA異常甲基化與UC密切相關(guān)

大量研究表明，UC是由多個(gè)基因的遺傳易感性與免疫、環(huán)境因素的異常相互作用引起。UC相關(guān)基因甲基化狀態(tài)變化可以顯著改變基因表達(dá)水平，可能導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展[6]。有研究顯示，將UC初次治療患者（n = 10）及健康對(duì)照組（n = 11）的全基因組DNA甲基化測(cè)序?qū)Ρ确治觯Y(jié)果顯示在DNA甲基化差異基因中有25個(gè)基因已被證實(shí)為炎癥性腸?。↖BD）易感基因，其中6個(gè)基因在其TSS具有CGI[7]。30%的基因CpG位點(diǎn)甲基化靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且約25%顯著差異表達(dá)基因與DNA甲基化類型相關(guān)。因此說明，UC中存在其相關(guān)基因的CpG位點(diǎn)甲基化，可能與UC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

DNA甲基化和消化道的炎癥狀態(tài)密切相關(guān)，慢性炎癥通過誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞DNA異常甲基化參與UC發(fā)生發(fā)展，提示DNA甲基化是慢性炎癥的一個(gè)結(jié)果[8]。IFN-γ的表達(dá)不僅對(duì)炎癥的發(fā)展和維持至關(guān)重要，而且在IBD發(fā)病機(jī)制及IBD風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域側(cè)翼IFN-γ基因（IFNG）發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，第3個(gè)IFNG內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)新單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs1861494 T/C[9]。該SNP位點(diǎn)同時(shí)也為CpG甲基化引入新位點(diǎn)。進(jìn)一步研究顯示，特定的等位基因序列和甲基化水平均可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與rs1861494區(qū)域的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)IFN-γ的表達(dá)。T至C的取代引入新的CpG二核苷酸序列，新位點(diǎn)的甲基化與IFN-γ表達(dá)降低相關(guān)。

對(duì)UC炎癥活動(dòng)性相關(guān)的45個(gè)高甲基化基因進(jìn)行聚類分析結(jié)果提示，在UC患者中活動(dòng)期炎癥黏膜較非活動(dòng)期炎癥黏膜其相關(guān)基因表現(xiàn)出更高的甲基化水平[10]。但上述高甲基化基因與UC病程并無相關(guān)性，可能與僅對(duì)其炎癥黏膜活動(dòng)期和非活動(dòng)期區(qū)分，而未區(qū)分是否發(fā)生非典型增生或癌變有關(guān)。研究表明，與無非典型增生相比，UC患者的非典型增生和周圍無非典型增生的腸道黏膜DNA甲基化增加[8]。

由于炎癥中較高的細(xì)胞更新，所以UC可被視為一種組織過早老化的疾病。而一些基因在非腫瘤組織中因老化而發(fā)生并加速甲基化，這類改變稱為年齡相關(guān)甲基化[8]。研究發(fā)現(xiàn)，SOX17、CDH13、DPYS、MLF1、SOX11、GDNF、N33和SCL16A12等基因在UC中甲基化程度加速，且與較長(zhǎng)的UC病程相關(guān)，認(rèn)為炎癥持續(xù)時(shí)間比當(dāng)前炎癥程度更重要。另外，此研究還發(fā)現(xiàn)DPYS、N33在腫瘤性UC組織及近瘤組織中甲基化程度更高[11-12]。一些年齡相關(guān)甲基化基因ER、MYOD、p16外顯子1和CSPG2在UC中甲基化程度與不典型增生程度正相關(guān)[11]。

三、DNA甲基化在UC作用的可能機(jī)制

DNA甲基化異常包括全基因組的低甲基化和局部基因的高甲基化。根據(jù)基因功能不同，其甲基化類型也不同。參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及防御的基因觀察到高甲基化，而與免疫應(yīng)答相關(guān)基因則觀察到低甲基化[13]。在黏膜炎癥過程中，上皮細(xì)胞的比例減少，導(dǎo)致腸通透性受損和體內(nèi)平衡失調(diào)。這可能是由于富含脯氨酸的酸性蛋白1和參與維持上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的溶質(zhì)載體蛋白家族成員SLC6A19和SLC3A1的高甲基化和表達(dá)下調(diào)所致。此外，參與腸道黏膜防御系統(tǒng)的基因也檢測(cè)到高甲基化。腸道堿性磷酸酶1和防御素B1與上皮表面對(duì)微生物定植的抵抗力有關(guān)，而UDP葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶家族UGT1A10和UGT1A8與限制胃腸黏膜通過細(xì)胞色素P450系統(tǒng)對(duì)有害化學(xué)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)，這些基因在UC中均出現(xiàn)高甲基化。同時(shí)參與胃腸液和電解質(zhì)平衡的鳥苷酸環(huán)化酶激活劑GUCA2A和GUCA2B也檢測(cè)到高甲基化，這可能與其在炎癥中下調(diào)有關(guān)。此外，所檢測(cè)到UC相關(guān)低甲基化且在UC中上調(diào)的基因，大多數(shù)與先天免疫系統(tǒng)相關(guān)，例如趨化因子、趨化因子受體、細(xì)胞因子、IL和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。此研究也發(fā)現(xiàn)，BTNL3、DEFA、OLFM4和REG1B存在非CpG甲基化，而這些基因不僅參與炎癥反應(yīng)及可能與抗菌活性有關(guān)，也參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展。然而非CpG甲基化機(jī)制尚未明確，需待進(jìn)一步研究和證實(shí)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）與UC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[14]。EMT是黏附上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型的一種現(xiàn)象，能增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)基因CDH1和CDH13啟動(dòng)子甲基化和患者年齡顯著相關(guān)，并且與UC病程具有相同趨勢(shì)。說明EMT相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化與UC的發(fā)病過程有關(guān)。

四、DNA甲基化在UC中的臨床意義

DNA甲基化在各種疾病包括UC的診斷及治療上均有一定意義[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1614、RIBC2和FAM217B這3個(gè)基因在UC中高度甲基化，認(rèn)為檢測(cè)其甲基化情況可能作為UC診斷和治療的潛力標(biāo)志物[10]。一些基因的啟動(dòng)子CGI僅在嚴(yán)重表型UC發(fā)生甲基化，它們所編碼的蛋白質(zhì)通常參與生物合成、代謝調(diào)節(jié)及氮化合物代謝過程，如ZNF582、ZNF614、ZNF274、ZNF583和ZNF559等基因，并且部分基因已被報(bào)道在其他腫瘤中發(fā)生高甲基化[12]。此外據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CDX1、miR-1247高甲基化與UC難治性表型正相關(guān)，miR-1247、CDH1高甲基化與較嚴(yán)重Mayo內(nèi)鏡評(píng)分相關(guān)[14]。據(jù)報(bào)道，UC中RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員1轉(zhuǎn)錄變異體A（RASSF1A）基因甲基化明顯高于克羅恩病，因此認(rèn)為RASSF1A基因甲基化可能作為臨床鑒別UC與克羅恩病的指標(biāo)之一[16]。研究顯示，Uhrf1基因的缺乏和突變均使葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理小鼠的腸道炎癥加重，其原因是腸道巨噬細(xì)胞Uhrf1可介導(dǎo)TNF-α啟動(dòng)子的甲基化，因此開發(fā)Uhrf1介導(dǎo)TNF-α啟動(dòng)子的甲基化，使TNF-α對(duì)UC患者腸道組織損傷作用的減弱，為UC治療開拓新的思路[17]。某些基因的甲基化與UC相關(guān)結(jié)腸癌有關(guān)，這為臨床提示UC癌變提供預(yù)測(cè)指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中過表達(dá)miR-34b-5p可顯著降低細(xì)胞增殖、集落形成和侵襲能力，而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-34b-5p在UC相關(guān)性結(jié)腸癌中低表達(dá)的原因之一是啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化，因此通過檢測(cè)UC組織中是否出現(xiàn)miR-34b-5p高度甲基化，可能提示UC是否出現(xiàn)癌變[18]。也有研究者分析UC相關(guān)結(jié)直腸癌患者結(jié)腸上皮CpG位點(diǎn)DNA甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2（CRHR2）在癌與非癌黏膜組織的甲基化水平差異最大，提示CRHR2基因高甲基化檢測(cè)有可能用于UC患者的腫瘤篩查[19]?？傊行┗虻募谆潭扰cUC的非典型增生甚至癌變相關(guān)，這不僅為病理及內(nèi)鏡下對(duì)病變的診斷和鑒別診斷提供重要的依據(jù)，而且還為UC的早期手術(shù)治療提供新指征。而另一些基因僅在嚴(yán)重表型UC患者中呈現(xiàn)高度甲基化，這對(duì)該類UC治療提供新的方向。

不少研究證實(shí)UC的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群有關(guān)，并且可以通過菌群移植治療UC[20-21]。然而腸道菌群對(duì)DNA異常甲基化是否有影響？有研究發(fā)現(xiàn)，通過用環(huán)丙沙星、甲硝噠唑、新霉素和萬古霉素等抗生素治療DSS及氧化偶氮甲烷（AOM）鼠UC模型，結(jié)果顯示已增生的黏膜結(jié)節(jié)數(shù)量減少、直徑減小，由DSS及AOM誘導(dǎo)基因甲基化效應(yīng)減弱，Cbln4、Fosb和Msx1的CGI甲基化增加程度被抑制約50% ～ 92%[22]。同時(shí)炎癥相關(guān)基因Nos2表達(dá)被顯著抑制，TNF呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。由此說明，通過抗生素調(diào)控腸道特定菌群不僅可以緩解UC的腸道炎癥，也可以抑制UC的癌變，說明抗生素治療UC具有一定可行性，同時(shí)也說明UC相關(guān)基因CGI甲基化參與這一過程。

最近研究表明，唾液具有替代上皮黏膜來進(jìn)行DNA甲基化研究的潛力。將唾液和腸道黏膜中的DNA甲基化譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示唾液和腸道黏膜的全局DNA甲基化在個(gè)體內(nèi)呈正相關(guān)。唾液作為一種高質(zhì)量甲基化譜，相比腸道黏膜具有無創(chuàng)、易收集的顯著優(yōu)勢(shì)[23]。但是唾液是否可以完全取代腸道黏膜對(duì)UC患者DNA異常甲基化的檢測(cè)，尚需進(jìn)一步研究。

五、展 望

UC是以慢性炎癥為特征的一種疾病，而DNA異常甲基化不僅是慢性炎癥的結(jié)果，也能促進(jìn)腸道炎癥，與嚴(yán)重表型UC相關(guān)。DNA異常甲基化既是因又是果，與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并隨著UC病程的增加及異常甲基化基因的增加，使UC向UC相關(guān)大腸癌演變。那么如何檢測(cè)及阻止DNA異常甲基化對(duì)治療UC及預(yù)防癌變尤為重要。總而言之，在UC病因機(jī)制的研究及診斷和治療途徑的拓展等方面，或許DNA甲基化擔(dān)任更加重要的角色。

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（收稿日期：2019-11-21）

（本文編輯：楊江瑜）