秦浩，張亞波，孫秀英，尹航，莊強

棗莊市立醫(yī)院，山東棗莊 277100

未破裂顱內(nèi)動脈瘤(UIAs)的主要危險是動脈瘤破裂引起顱內(nèi)出血，發(fā)病率較高，具有潛在的致死及致殘風(fēng)險[1]。盡管UIAs較為常見，但僅有少部分患者出現(xiàn)破裂，對高危動脈瘤破裂的患者應(yīng)早期診斷，并予以積極預(yù)防或治療，減少嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生[2]。微小RNA(miRNA)長度為18～25個核苷酸，成熟的miRNA構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，結(jié)合靶基因信使RNA的3′非編碼區(qū)，調(diào)控靶基因的表達(dá)，在發(fā)育、分化及衰老等生物過程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究表明，miRNA在動脈瘤形成及發(fā)展中起重要作用[4]。miR-126基因位于9q34.3，研究發(fā)現(xiàn)，miR-126主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能，與血管發(fā)生、修復(fù)等過程密切相關(guān)[5]。動脈瘤的發(fā)生與血管平滑肌細(xì)胞的異常有關(guān)，其凋亡過度可引起血管壁重塑，導(dǎo)致動脈瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b能調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與動脈瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6.7]。本研究通過檢測UIAs患者血清miR-126和miR-125b表達(dá)，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月～2019年2月我院診治的198例UIAs患者(病例組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)腦血管造影或核磁共振血管成像明確診斷為UIAs；②初次診治，既往無手術(shù)或藥物治療史；③顱內(nèi)動脈瘤未破裂。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的頭部外傷史；②有腦血管卒中病史；③臨床資料不完整。病例組中男112例、女86例，年齡32～77(42.1±5.5)歲。動脈瘤數(shù)目：1個138例，2個及以上60例；動脈瘤瘤徑<7 mm者107例，≥7 mm者91例；動脈瘤位置：前循環(huán)動脈瘤132例，后循環(huán)動脈瘤66例。以同期60例查體健康者作為對照組，均經(jīng)數(shù)字減影血管造影或核磁共振血管成像除外顱內(nèi)動脈瘤，其中男44例、女16例，年齡30～76(41.9±5.9)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過，患者及家屬對本研究均知情理解并簽字。

1.2 血清miR-126和miR-125b檢測方法 采用qRT-PCR法。取病例組入院后第1天、對照組查體時晨起空腹靜脈血5 mL，4 ℃下4 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，留取上清-80 ℃冰箱保存。取200 μL樣品，應(yīng)用TRIzol法提取血清中總RNA，用異丙醇沉淀總RNA后75%乙醇洗滌RNA，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥RNA，50 μL的DEPC水溶解，Narodrop檢測RNA溶液的濃度及純度，OD260/OD280介于1.8～2.1。以總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 16 min，84 ℃ 6 s。qRT-PCR反應(yīng)總反應(yīng)體系20 μL，模板cDNA 1 μL，Taq聚合酶0.2 μL、正向及反向引物各1 μL、2×SYBR Green mix 1 μL及20 mmol/L dNTPs 1 μL，無RNA酶水14.8 μL。反應(yīng)條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，70 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。miR-126正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3′，反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-

GCATTAT-3′；miR-125b正向引物：5′-GCCGTAAAGTGCTGACAGT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；內(nèi)參基因U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物:3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。結(jié)果采用相對定量法表示，目的基因miR-126、miR-125b的表達(dá)分別相對于內(nèi)參基因U6的比值為2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.3 血清MMP-9檢測方法 采用ELISA法。取病例組入院后第1天、對照組查體時清晨空腹靜脈血約5 mL，EDTA抗凝，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清，-80 ℃保存。實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，人基質(zhì)金屬蛋白酶ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。450 nm波長處測各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本OD值計算對應(yīng)的濃度值。每個標(biāo)本重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-126和miR-125b表達(dá)比較 病例組血清miR-126、miR-125b相對表達(dá)量分別為2.967±0.224、2.156±0.122，對照組分別為0.914±0.113、2.968±0.129。與對照組相比，病例組miR-126相對表達(dá)量較高(t=68.340，P=0.000)，而miR-125b相對表達(dá)量較低(t=44.562，P=0.000)。

2.2 病例組血清miR-126和miR-125b表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 見表1。

表1 病例組血清miR-126和miR-125b表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

2.3 病例組血清miR-126、miR-125b表達(dá)與血清MMP-9水平的關(guān)系 病例組及對照組血清MMP-9分別為(551.27±78.93)、(539.25±72.87)ng/mL，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.015，P=0.294)。病例組血清miR-126表達(dá)與血清MMP-9呈正相關(guān)(r=0.715，P=0.000)，而miR-125b表達(dá)與血清MMP-9呈負(fù)相關(guān)(r=-0.625，P=0.000)。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，血流動力學(xué)參數(shù)、動脈瘤形態(tài)特征等指標(biāo)在顱內(nèi)動脈瘤破裂中起重要作用[8]。近年來發(fā)現(xiàn)，動脈瘤的發(fā)生機制是由于血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)彈性層產(chǎn)生和降解之間的不平衡，導(dǎo)致腦血管炎癥的發(fā)生，進而誘導(dǎo)動脈瘤的起始、形成、生長和隨后的破裂[9]。miRNA與血管炎癥的調(diào)節(jié)關(guān)系密切，并且在顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動脈瘤患者血清中如miR-126、miR-125b等miRNA異常表達(dá)，其可通過調(diào)控負(fù)責(zé)降解血管內(nèi)彈性層成分(蛋白聚糖、彈性蛋白等)MMP-9的表達(dá)，影響顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。

miR-126基因位于人類9號染色體，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，成熟的miR-126能參與調(diào)控血管細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，參與血管的生成、發(fā)育、修復(fù)及重塑等生物學(xué)功能[11]。本研究中，病例組血清miR-126表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明miR-126參與UIAs的發(fā)生發(fā)展，其原因可能是顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生時，脈管系統(tǒng)的重新激活促進血管的生成過程，從而促進miR-126的表達(dá)，而miR-126能通過抑制出芽相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進血管的生成過程[12]。此外，miR-126表達(dá)與UIAs的數(shù)目及直徑有關(guān)，表明miR-126可能參與促進顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生發(fā)展。在動脈瘤發(fā)生過程中，MMP-9可通過降解Ⅳ型膠原蛋白，發(fā)揮促進血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。本研究中，病例組血清miR-126與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其機制可能是miR-126對負(fù)調(diào)控MMP-9的信號通路有關(guān)。有研究表明，miR-126能通過抑制Akt/p53信號通路，負(fù)性調(diào)控p53基因的表達(dá)[13]，而p53能負(fù)性調(diào)控MMP-9的表達(dá)，因而miR-126表達(dá)升高促進MMP-9表達(dá)[14]。

miR-125家族是進化過程中高度保守的miRNA家族，由miR-125a、miR-125b等成員組成，miR-125家族的異常表達(dá)與炎癥、免疫及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。研究表明，miR-125b是一種腫瘤抑制因子，在腹主動脈瘤中存在異常表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，參與血管壁炎癥與抗炎平衡的調(diào)節(jié)[16]。本研究中，病例組血清miR-125b的表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其機制可能是長鏈非編碼RNA(LncRNA)如MALAT1對miR-125b的表達(dá)抑制作用有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1能作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-125b的表達(dá)，導(dǎo)致miR-125b水平降低[17]。此外，miR-125b表達(dá)與UIAs的數(shù)目及直徑有關(guān)，其原因可能是miR-125b能抑制下游靶標(biāo)包括STAT3等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，STAT3結(jié)合于MMP-9的啟動子區(qū)減少，MMP-9的水平降低，而UIAs時miR-125b表達(dá)降低后導(dǎo)致MMP-9水平升高，MMP-9降解顱內(nèi)動脈血管內(nèi)彈性層，導(dǎo)致UIAs的數(shù)目增多及直徑增大[18]。

綜上所述，UIAs患者血清中miR-126表達(dá)升高，miR-125b表達(dá)降低；檢測二者表達(dá)有助于判斷UIAs數(shù)目和直徑。