舒錦，汪海婭，金立

1.上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院老年科，上海200443；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院老年科，上海200001

隨著社會老齡化的發(fā)展，心血管疾病嚴重威脅老年人的健康和生命。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是以心臟間質(zhì)成纖維細胞過度增殖、膠原過度沉積及異常分布為特征的心臟間質(zhì)重構，是各種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理表現(xiàn)，最終導致心臟功能衰竭而死亡[1]。目前對MF 的發(fā)病機制并不十分明確。血管緊張素II（AngII）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的中心信號分子，對心肌細胞的成纖維化過程具有十分重要作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶3（）是細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，參與疾病的發(fā)生、組織修復和重塑。研究發(fā)現(xiàn)，在AngII 誘導的大鼠心臟成纖維細胞中顯著上調(diào)，并且其在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中具有較高的節(jié)度點，是心臟重構的關鍵基因[3]。本研究通過構建過表達和敲低的細胞，探討對心肌纖維化細胞活力的影響，為預防和逆轉心肌纖維化探索新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9C2 購自于中國科學院細胞庫。AngII 和左卡尼汀采購自上海源葉生物科技有限公司?？蛰d體、過表達質(zhì)粒、si-RNA-negative control (siRNA-NC)、siRNA-（1/2/3）由研載生物技術（上海）有限公司提供。Lipofectamin 300 采購自Thermo Fisher Scientific 公司。RNA 逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）和RNAiso Plus購自于TaKaRa 公司。CCK8 檢測試劑盒購自于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 大鼠心肌細胞H9C2 用新鮮配制的含10%胎牛血清和1%雙抗的DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換培養(yǎng)液，觀察細胞的貼壁情況。當細胞貼壁生長至80%～90%時，進行細胞傳代。

1.2.2 細胞轉染 培養(yǎng)好的H9C2 細胞用無雙抗的完全培養(yǎng)液重懸細胞，按每孔5×105個細胞，將細胞接種至6 孔板中，細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。次日，更換細胞培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液，每孔1 500L。根據(jù)制造商的說明，利用Lipofectamin 3000 制備不同的細胞轉染液。即：a，4LLipofectamin 3000+250L 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫靜置5 min；b，3g 空載體/過表達質(zhì)?；?00 nM siRNA-NC/siRNA-(1/2/3) +250L 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫靜置5 min；將上述a、b 混合，室溫靜置20 min，制備成不同的細胞轉染液空白對照組只添加Lipofectamin 3000 和無血清培養(yǎng)基。將上述制備完成的不同細胞轉染液轉接于6 孔板中，6 h 后，更換培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，收集細胞，用RNA 提取試劑盒提取不同組別細胞的總RNA，熒光定量PCR 檢測的表達水平，用于評估細胞的轉染效率。

1.2.3 AngII 處理 細胞最佳條件的篩選按每孔5×105個細胞，將H9C2 細胞接種至12 孔板中，放置于細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。分別用0、10-8、10-7、10-6M 的AngII 分別處理H9C2 細胞6 h，12 h 和24 h。處理后，收集不同時間點的細胞，提取其細胞總RNA，用于后續(xù)的分析。

1.2.4 熒光定量PCR （RT-qPCR）參照Liu 等[4]的方法進行RT-qPCR 分析。根據(jù)RNA 逆轉錄試劑盒的說明書，對提取的RNA 進行反轉錄，合成cDNA。然后進行RT-qPCR 擴增，其引物序列如表1所示。RTqPCR 的反應條件為50℃3 min，95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40 個循環(huán)。其中，GAPDH 作為內(nèi)參，和Axl 的mRNA 表達水平采用2-△△Ct 方法計算[5]。

表1 引物序列

1.2.5 CCK-8 檢測細胞活力 心肌細胞的活力用CCK-8檢測試劑盒進行檢測。按每孔5×105個細胞，將H9C2細胞接種至6 孔板中，細胞培養(yǎng)箱中過夜。將細胞分成H9C2 組、心肌細胞纖維化組（MF 組）、MF+si-NC組、MF+si-組和MF+組。其中，MF 組、MF+si-NC 組、MF+si-組和MF+組的細胞均先用10-8M 濃度的AngII 處理24 h 后，分別用不同的細胞轉染液轉染H9C2 細胞。H9C2 組用等劑量的PBS 以相同方式進行處理。細胞轉染24 h 后，對5 組細胞進行細胞計數(shù)。將上述5 組細胞按每孔1×104個細胞接種于96 孔板中，混勻后，細胞培養(yǎng)箱中過夜。第2 天用100M 左卡尼汀處理MF 組和MF+組的細胞，其余組的細胞用等劑量的PBS 處理。培養(yǎng)24、48、72 和96 h 時后，每孔加入10L CCK-8 溶液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h 后（OD 值≤2.0），用酶標儀在波長450 nm 處檢測其吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 作圖和統(tǒng)計分析軟件均為Graphpad prism 5。計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較進行單因素方差（one-way ANOVA）分析。以＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染的效率 采用RT-qPCR 檢測細胞轉染后的mRNA 表達水平。見圖1。與siRNA-NC 組相比，的表達水平在siRNA-(1) 組和siRNA-(2) 組中均降低（＜0.01），但其在siRNA-(1) 中，其下降幅度更大（圖1A）。因此在后續(xù)的實驗中，采用siRNA-(1) 進行轉染H9C2 細胞，構建敲低的細胞。圖1B 表明，與空載質(zhì)粒組相比，的mRNA 表達水平在過表達組中增加（＜0.01），其值約是空載質(zhì)粒組的80 000 倍。說明過表達細胞成功構建，可用于進一步實驗。

2.2 AngII 最佳濃度的選擇 圖2顯示，用不同濃度的AngII 處理細胞6 h 后，Axl 的表達水平與未用AngII處理的相比差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；而處理12 h后，Axl 的表達水平僅在濃度為10-8M 組中下降（＜0.05）。當處理24 h 后，與未處理的相比，Axl 的表達水平在用不同濃度AngII 處理的組別中均下調(diào)（＜0.01），并且濃度為10-8M 的效果更顯著。因此，本研究最終選用濃度為10-8M 的AngII 處理細胞24 h，誘導心肌細胞H9C2 纖維化。

圖1 在干擾和過表達中的mRNA 表達水平：與空白對照相比，**＜0.01；與siRNA-NC 組相比，#＜0.01

圖2 不同濃度的AngII 處理H9C2 細胞6 h、12 h 和24 h 后，Axl 基因的mRNA 表達水平。與未用AngII 處理的相比，*＜0.05、**＜0.01

圖3 不同方式處理H9C2 細胞24 h（A）、48 h（B）、72 h（C）和96 h（D）后的細胞活力。與H9C2 組相比，＜0.05；與MF 組相比，＜0.05；與MF+100 M 左卡尼汀組相比，＜0.05

3 討論

MF在心臟和血管重塑的發(fā)病機制中起重要作用，與高血壓、心肌梗死、動脈粥樣硬化、糖尿病等臨床許多疾病和病理過程有著密切的聯(lián)系[6-8]。MF 可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴重并發(fā)癥，預防和逆轉心肌纖維化有助于為治療老年心血管疾病提供新的分子靶點。

AngII 是一種血管活性肽，對心肌細胞、成纖維細胞和血管平滑肌細胞有直接促進生長的作用，從而導致心血管重構，所以常作為一種促纖維化因子被用于誘導心肌細胞的成纖維化[9]。Axl 屬于受體酪氨酸激酶，其在脈管系統(tǒng)、心肌、血管內(nèi)皮等正常組織以及多種腫瘤組織中均有表達，與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切的關系，Axl 的表達水平與心肌纖維化過程密切相關[10]。因此，本研究采用不同濃度的AngII處理大鼠心肌細胞不同時間，通過測量Axl 的表達情況來選擇最佳的處理濃度與時間。結果表明，10-8M的AngII 處理H9C2 心肌細胞24 h，可以誘導細胞纖維化。

當心肌成纖維化細胞被激活增殖時，細胞外基質(zhì)的合成分泌會增強，從而進一步促進細胞纖維化[11]。因此，通過抑制心肌成纖維化細胞的活性和增殖，可以抑制心肌成纖維化的過度積累，延緩心肌重構的發(fā)展。左卡尼汀是一種心肌能量代謝藥物，可對心肌代謝予以調(diào)節(jié)，并有研究證實左卡尼汀可以有效的治療心肌炎[12]。不僅能夠降解膠原，而且還能降解基底膜成分，是其他幾種（-1，-7，-8，-9）的激活劑[13]。本研究通過檢測心肌成纖維化細胞的細胞活性，來探究對心肌成纖維化過程的影響。結果表明，當成纖維化細胞中敲低時，細胞活性受到抑制，與用100M 左卡尼汀處理后的細胞活性相似；而當成纖維化細胞中過表達時，其細胞活性增強；說明敲低可以抑制心肌成纖維化細胞的活性，抑制其纖維化過程。有證據(jù)顯示，在動脈粥樣硬化中，表達的增加更容易增加斑塊破裂的可能性，從而促進心肌梗死和中風的發(fā)生[14]。Münch 等[15]分析了54 例肥厚型心肌患者的纖維化生物標記物，研究結果顯示，的表達水平與心臟疾?。〞炟?，心室性心博過速等）呈正相關關系。此外，另外一項研究表明，與假手術組相比，在結扎小鼠冠狀動脈左前降支（一種心衰模型）的動物模型中，的表達水平上調(diào)，心肌纖維化增加；表明的上調(diào)與心肌纖維化的增加密切相關[16]。結合本研究結果，可以推測過表達會促進心肌纖維化過程，而敲低可能會通過降低心肌纖維化細胞的活力，來抑制成纖維化細胞的增殖，從而延緩老年患者心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生。