任利成，崔 旭

(1.深圳大學(xué)總醫(yī)院，廣東 深圳 518055；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

瘢痕是人體皮膚組織受到一定程度損傷后自然愈合所形成的產(chǎn)物，瘢痕癌是皮膚瘢痕發(fā)生癌變而形成的皮膚癌，瘢痕癌確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未清楚.lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，同編碼RNA一樣，lncRNA同樣也參與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)組成，影響包括癌癥發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞分化、機(jī)體生長發(fā)育以及創(chuàng)面愈合等多種生物過程[1]，其在皮膚瘢痕化及后續(xù)瘢痕癌變中的作用值得進(jìn)一步研究.基因芯片雜交測序檢測RNA的原理是將一組已知序列的核酸探針固定在一塊基片表面，將樣本中RNA使用引物方法放大并轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA，當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的cRNA與芯片上的探針雜交互補(bǔ)匹配時(shí)，根據(jù)芯片探針位置和熒光強(qiáng)度分析得出樣本的核酸序列.本研究利用高通量基因芯片技術(shù)，比較瘢痕癌患者正常皮膚組織、未癌變瘢痕組織及癌變瘢痕組織中差異表達(dá)的LncRNA、mRNA，并進(jìn)一步分析這些差異表達(dá)的lncRNA、mRNA，以探討瘢痕及瘢痕癌變發(fā)病的可能分子機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集和保存

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院燒傷重建外科且經(jīng)病理確診的瘢痕癌患者，所取標(biāo)本包括患者正常皮膚組織、未癌變瘢痕組織及癌變瘢痕組織.所有研究病例均通過中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并于術(shù)前簽署知情同意書.

1.2 RNA的提取、標(biāo)記、雜交

將組織樣品置入裝有液氮的無菌研缽中，并在液氮條件下研磨成粉末狀，隨后裝入離心管，加入TRIZOL試劑，提取總RNA.應(yīng)用NanoDrop ND-1000的紫外分光光度計(jì)評估所提取的RNA量及質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)的變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用Arraystar人類LncRNAV3.0芯片(Arraystar公司，美國)檢測樣本中LncRNAs的表達(dá).根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行樣品標(biāo)記和基因芯片雜交：1)從總RNA中移除rRNA，得到mRNA；2)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA；3)根據(jù)RNeasymini Kit總RNA試劑盒檢測純化標(biāo)記的cRNAs，應(yīng)用NanoDrop ND-1000檢測其濃度和活性；4)芯片雜交；5)洗滌、固定并掃描雜交芯片.

1.3 分析方法

通過Agilent Feature Extraction軟件獲得不同組別的芯片圖，并獲得原始數(shù)據(jù)，進(jìn)一步使用GeneSpring GX V12.1軟件對所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化及數(shù)據(jù)處理.樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)LncRNA或mRNA通過P-value進(jìn)行FDR篩選，參選標(biāo)準(zhǔn)：組間基因表達(dá)差異倍數(shù)2倍以上(P<0.05，中國上?？党缮锕就瓿缮鲜鰯?shù)據(jù)分析).對位于差異lncRNA附近(<100 kb)，且差異表達(dá)的蛋白編碼基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和信號通路(Pathway)分析.

1.4 RT-PCR驗(yàn)證部分篩選的LncRNA

為進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNAs在不同組別標(biāo)本中存在差異表達(dá)，我們選取實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的部分差異表達(dá)的LncRNAs(ENST00000457834，ENST00000552486，ENST00000414600，ENST00000582505，ENST00000432 694，TCONS-00006917，TCONS-00023477，uc021uyg.1，TCONS-00020439)，以實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)一步檢測他們在正常皮膚組織、瘢痕組織以及瘢痕癌組織中的表達(dá)情況.在50 mg組織樣品中加入1 mL的TRIZOL試劑，然后提取總RNA.根據(jù)Super Script TM III Reverse Transcriptase試劑盒RNA酶抑制劑的使用說明，對抽提的樣品RNA進(jìn)一步行cDNA合成，再行PCR反應(yīng)，并以管家基因β-actin作內(nèi)參.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 樣品RNA電泳分析

本實(shí)驗(yàn)中共提取9個(gè)樣品的RNA，其中有8個(gè)樣品的純度和總量符合芯片實(shí)驗(yàn)要求.電泳圖顯示其中一瘢痕癌組樣品降解相對嚴(yán)重，替換了新的樣品，RNA純度和總量均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求.總RNA質(zhì)檢參數(shù)(核酸純度指示值)的OD260/OD280≥1.8，瓊脂糖凝膠電泳檢測有清晰的18S和28S rRNA條帶，28S rRNA亮度約為18S rRNA的1～2倍.見圖1.

2.2 LncRNAs與mRNA的差異表達(dá)

瘢痕癌組織與鄰近未癌變瘢痕組織比較有477種LncRNA表達(dá)上升，1 576種表達(dá)下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).瘢痕癌組織與正常皮膚組織比較有1 753種LncRNA表達(dá)上升，2 435種表達(dá)下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).見表1～2，圖2.其中有125種LncRNA在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織的表達(dá)呈遞增式上升，324種LncRNA呈遞減式下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).瘢痕癌組織與鄰近未癌變瘢痕組織比較，有2 353種mRNA表達(dá)上升，1 588種表達(dá)下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).瘢痕癌組織與鄰近正常皮膚組織比較，有5 321種mRNA表達(dá)上升，1 879種表達(dá)下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).見圖2.其中有220種mRNA在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織表達(dá)呈遞增式上升，206種mRNA呈遞減式下降(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).

表1 瘢痕癌組織與瘢痕組織上調(diào)和下調(diào)前10位的lncRNA

表2 瘢痕癌組織與正常皮膚組織上調(diào)和下調(diào)前 10 位的 lncRNA

2.3 基因本體論分析和信號通路分析

瘢痕癌組織與鄰近未癌變瘢痕組織比較，差異表達(dá)的lncRNA功能預(yù)測較為富集的是免疫反應(yīng)、趨化因子活性、細(xì)胞周期、蛋白結(jié)合.瘢痕癌組織與正常皮膚組織比較，差異表達(dá)的lncRNA功能預(yù)測較為富集的是生長調(diào)節(jié)、硫化物結(jié)合、蛋白質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)結(jié)合.信號通路(Pathway)分析發(fā)現(xiàn)：瘢痕癌組織與鄰近未癌變瘢痕組織比較，43條信號通路表達(dá)上升，其中富集積分最高的是腫瘤蛋白p53信號通路，44條信號通路表達(dá)下降，其中富集積分最高的是趨化因子信號通路.瘢痕癌組織與正常皮膚組織比較，89條信號通路表達(dá)上升，其中富集積分最高的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程，44條信號通路表達(dá)下降，其中富集積分最高的是黑素合成.

分析腫瘤相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)：癌基因MDM2、Annexin A2 mRNA表達(dá)在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織中呈漸進(jìn)性上升趨勢，而Annexin A9 mRNA表達(dá)則呈漸進(jìn)性下降趨勢.Annexin A 差異表達(dá)與LncRNA TCONS-00001679N表達(dá)密切相關(guān)，分析膠原合成相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)：TGF-βmRNA在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織呈遞增式上升，LncRNA NR-046268的表達(dá)下降與TGF-β表達(dá)上升密切相關(guān).

2.4 RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

從正常皮膚組織、瘢痕組織及瘢痕癌組織中選擇差異表達(dá)基因，以管家基因β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到結(jié)果與預(yù)期一致，RT-PCR驗(yàn)證分析得到的結(jié)果與基因芯片篩選的差異基因表達(dá)一致.部分LncRNAs正常皮膚組織、瘢痕組織以及瘢痕癌組織中的表達(dá)呈遞增性或遞減性改變.見圖3.

3 討 論

瘢痕癌是發(fā)生于皮膚瘢痕組織的惡性腫瘤，尤其是一些深Ⅱ度、Ⅲ度燒傷或創(chuàng)傷后久治不愈、反復(fù)潰爛的瘢痕組織其癌變率為1%～2%[2-3].瘢痕癌發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，主要觀點(diǎn)認(rèn)為其多發(fā)生于反復(fù)破潰合并感染的創(chuàng)面，與長期慢性炎癥刺激有關(guān)；也有觀點(diǎn)認(rèn)為與瘢痕組織局部血液循環(huán)差、免疫缺陷、機(jī)體對腫瘤細(xì)胞監(jiān)控減弱有關(guān).許多蛋白編碼基因在瘢痕癌發(fā)生中都出現(xiàn)了異常表達(dá)[2-4]，lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，參與了多種生理功能及疾病的調(diào)控.盡管目前對lncRNA的功能了解很少，但根據(jù)已有的研究發(fā)現(xiàn)其對機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持非常重要，它參與了X染色體沉默、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活、干擾等重要調(diào)控過程[4-6].越來越多的研究[4-6]發(fā)現(xiàn)：lncRNA與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣具有重要的調(diào)控作用.但目前關(guān)于lncRNA與瘢痕癌相關(guān)關(guān)系的研究不多.

本研究結(jié)果顯示：正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織之間部分lncRNA表達(dá)存在顯著差異(差異倍數(shù)fold≥ 2.0倍，P<0.05)，一些lncRNA在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織之間表達(dá)存在遞增式或遞減式變化(差異倍數(shù)fold≥ 2.0倍，P<0.05)，說明lncRNA與燒傷后皮膚瘢痕增生、瘢痕癌變密切相關(guān).

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53是一種抑癌基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、分化以及DNA修復(fù)[7].而癌基因MDM2編碼的蛋白質(zhì)通過與p53的17～22位氨基酸殘基相結(jié)合，阻斷p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路，或者與p53特異的泛素酶共同作用，促進(jìn)p53蛋白降解，使野生型p53基因的抑癌功能失活.Annexin A蛋白同樣在p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中具有重要作用[8-9].本研究發(fā)現(xiàn)：瘢痕癌組織中癌基因MDM2、Annexin A2 mRNA的表達(dá)較瘢痕組織、正常皮膚組織顯著增高(差異倍數(shù)fold≥ 2.0，P<0.05)，而且在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織中表達(dá)存在漸進(jìn)性上升趨勢.Annexin A家族中另一個(gè)重要成員Annexin A9 mRNA表達(dá)則在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織中存在漸進(jìn)性下降趨勢.Annexin A 差異表達(dá)與LncRNA TCONS-00001679N表達(dá)密切相關(guān)，說明LncRNA TCONS-00001679N極可能參與p53 signaling pathway所導(dǎo)致的組織癌變.TGF-β是已知的與膠原代謝、瘢痕形成最為密切的影響因子之一，它促進(jìn)了細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成，同時(shí)也抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性.在瘢痕尤其是病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10].TGF-β也參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，對正常細(xì)胞而言，TGF-β 具有抑制腫瘤的作用，而在惡性腫瘤細(xì)胞中，TGF-β則具有促進(jìn)腫瘤生長的作用[10].本研究結(jié)果顯示：TGF-βmRNA在正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織表達(dá)存在顯著性差異，呈遞增式上升(差異倍數(shù)fold≥2.0，P<0.05).LncRNA NR-046268表達(dá)下降與TGF-βmRNA表達(dá)上升密切相關(guān)，說明極可能參與了TGF-β在損傷后瘢痕增生及隨后的瘢痕癌變.

正常皮膚組織、瘢痕組織、瘢痕癌組織中l(wèi)ncRNA存在差異表達(dá)，LncRNA的差異表達(dá)與臨近蛋白編碼基因(腫瘤相關(guān)編碼基因)表達(dá)密切相關(guān).進(jìn)一步研究LncRNA的差異表達(dá)與臨近蛋白編碼基因的關(guān)系，將有助于我們進(jìn)一步了解皮膚瘢痕增生及瘢痕癌變的發(fā)生機(jī)制.