鄒麗君，張 娟，高艷芳，胡恭華

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，江西 贛州 341000)

苯和甲醛是典型的職業(yè)環(huán)境污染物和室內(nèi)空氣污染物[1]，引發(fā)的健康問題也成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。苯和甲醛均是人類確認的致癌物，兩種毒物長期高濃度接觸可導(dǎo)致肝腎、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種健康損害[2-4]，目前的研究多集中于苯和甲醛各自的健康損害及相關(guān)機制，兩種毒物的聯(lián)合作用且低濃度、短時間的毒性作用研究較少，本文擬通過對ICR小鼠進行苯和甲醛低濃度、短時間的聯(lián)合暴露來探討肝臟毒性，為相關(guān)研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雌性ICR小鼠54只，平均體重26.56 g[購自湖南斯克景達實驗有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002，使用許可證編號SYXK(贛)2018-0004]。屏障環(huán)境飼養(yǎng)和染毒，溫度18～24 ℃，濕度為40%～60%。

1.2儀器和試劑55 L靜式染毒柜(實驗室自制，塑料材質(zhì)、可密封、透明)，Sorvall ST 8R型高速冷凍式離心機(美國Thermo Fisher)，EON-EPOCH酶標儀(美國Biotek)，ZXDP-R2800電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城)，玻璃勻漿器；苯(分析純，國藥集團)，37%甲醛水溶液(分析純，國藥集團)，0.01 M PBS緩存液，CHO測試盒、TG測試盒、ALT測試盒、AST測試盒、SOD測試盒和MDA測試盒(南京建成)。

1.3實驗方法

1.3.1分組和染毒54只SPF級雌性ICR小鼠隨機分組均分9組，依次分為G1(空白對照組)、G2(低苯組，苯劑量12 mg·m-3)、G3(高苯組，苯劑量60 mg·m-3)、G4(低甲醛組，甲醛劑量2 mg·m-3)、G5(高甲醛組，甲醛劑量10 mg·m-3)、G6(低苯+低甲醛組，苯劑量12 mg·m-3+甲醛劑量2 mg·m-3)、G7(高苯+低甲醛組，苯劑量60 mg·m-3+甲醛劑量2 mg·m-3)、G8(低苯+高甲醛組，苯劑量12 mg·m-3+甲醛劑量10 mg·m-3)、G9(高苯+高甲醛組，苯劑量60 mg·m-3+甲醛劑量10 mg·m-3)，每組6只，呼吸道靜式染毒，連續(xù)染毒14天，2小時/天(中間間隔一小時)。染毒期間禁食禁水，其余時間自由飲水攝食，每7天測量一次體重。

1.3.2血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定染毒結(jié)束，10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血，5分鐘2 000 rmp離心分離血清，按照試劑盒的說明書測定和計算ALT和AST。

1.3.3肝臟組織超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測定染毒結(jié)束處死小鼠，解剖分離肝臟，稱量約0.1 g肝臟組織與PBS緩沖液按1∶9用玻璃勻漿器制備10%肝勻漿，10分鐘3 000 rmp離心，取上清液按照試劑盒說明書測定和計算測定肝臟組織SOD活力和MDA含量。

1.3.4血清總膽固醇(CHO)和血清甘油三酯(TG)測定染毒結(jié)束，10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血，5分鐘2 000 rmp離心分離血清，按照試劑盒說明書測定和計算CHO和TG。

2 結(jié) 果

2.1苯和甲醛聯(lián)合染毒14天小鼠體重變化情況苯不同劑量組小鼠體重增長不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組的體重增長呈現(xiàn)劑量越高增長越緩慢趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，苯和甲醛聯(lián)合染毒對小鼠的體重增長有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天小鼠體重變化情況

表2 各組小鼠體重增長的方差分析結(jié)果

2.2苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠ALT和AST的影響各處理組的ALT差異無統(tǒng)計學(xué)意義，無主效應(yīng)及交互作用；而AST無主效應(yīng)但呈現(xiàn)交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4。

表3 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠ALT和AST的影響

表4 各組小鼠ALT、AST方差分析結(jié)果

2.3苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠SOD活力和MDA含量的影響各處理組的肝組織SOD活力隨染毒劑量增加有下調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；苯不同劑量組MDA含量不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組MDA含量不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、6。

表5 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠SOD活力和MDA含量的影響

表6 各組小鼠SOD活力、MDA含量方差分析結(jié)果

2.4苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠CHO和TG的影響各處理組的CHO差異無統(tǒng)計學(xué)意義，無主效應(yīng)及交互作用。苯不同劑量組TG不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組TG差異無統(tǒng)計學(xué)意義，苯和甲醛聯(lián)合染毒對TG有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7、8。

表7 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對小鼠CHO和TG的影響

表8 各組小鼠CHO、TG方差分析結(jié)果

3 討 論

苯和甲醛作為人類確認的致癌物和致突變物，經(jīng)常聯(lián)合暴露于職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)空氣環(huán)境，如化工行業(yè)中用于原料生產(chǎn)各類化工產(chǎn)品、作為溶劑和助劑用于噴漆印刷行業(yè)和家居裝修材料等。隨著國家職業(yè)衛(wèi)生標準和環(huán)境衛(wèi)生標準的推廣實施，職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)空氣環(huán)境中兩者的暴露通常在較低的水平，在這種情況下，兩者是否存在聯(lián)合作用、其健康損害呈現(xiàn)何種特征是一個新的命題。根據(jù)我國職業(yè)接觸限值苯(PC-STEL：10 mg·m-3)及甲醛(MAC：0.5 mg·m-3)[5]，我們將本次苯和甲醛經(jīng)呼吸道染毒的劑量分別設(shè)置為0、12、60 mg·m-3和0、2、10 mg·m-3，按兩因素三水平的析因設(shè)計組合為9個不同染毒劑量組，對ICR小鼠進行14天單獨染毒與聯(lián)合染毒(2 h/天)，基本符合低濃度、短時間的聯(lián)合暴露。

從染毒期間小鼠體重變化的析因分析結(jié)果來看，苯不同劑量組小鼠體重增長不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組的體重增長呈現(xiàn)劑量越高增長越緩慢趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該劑量下的苯對小鼠體重的影響要高于甲醛，苯和甲醛聯(lián)合吸入染毒對小鼠的體重增長有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組體重增長較少，高劑量聯(lián)合組體重增長較多，說明該劑量下的苯對小鼠體重的影響要高于甲醛，聯(lián)合染毒時甲醛的暴露抵消了苯對體重的影響。肝臟是機體最大的代謝器官，肝功能的變化可以表征毒物的毒作用特點并為毒作用機制研究提供線索。ALT和AST這兩種轉(zhuǎn)氨酶是代表肝功能的生物標志物，ALT主要集中在肝臟，AST分布更廣泛，轉(zhuǎn)氨酶的升高說明肝功能可能發(fā)生損傷。我們的實驗結(jié)果顯示各處理組的ALT變化無統(tǒng)計學(xué)意義，而苯和甲醛對AST呈現(xiàn)交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量聯(lián)合染毒組AST水平較低，提示該劑量下的AST變化可能來自于肝臟或者其他系統(tǒng)的損傷，且聯(lián)合暴露的效應(yīng)與單獨暴露不同。SOD 是抗氧化系統(tǒng)中重要的酶類, 能特異地捕獲體內(nèi)生成的 O2-·，MDA 是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物, 是機體氧化損傷的標志物，已有研究證實苯與甲醛單獨染毒或聯(lián)合染毒在多種器官中都能發(fā)現(xiàn)SOD活力和MDA含量的變化，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系[6-7]。我們的實驗結(jié)果顯示，各處理組的肝臟SOD活力隨染毒劑量增加有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；苯不同劑量組MDA含量不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組MDA含量不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低劑量聯(lián)合染毒組MDA含量升高，高劑量聯(lián)合染毒MDA含量降低，且聯(lián)合染毒各組均高于單獨染毒。各處理組的SOD變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異說明該劑量下動物的抗氧化酶類還沒有顯著性改變，但MDA的結(jié)果說明該劑量下的苯和甲醛的暴露已出現(xiàn)肝臟氧化損傷，且聯(lián)合毒性更大，存在交互作用，結(jié)合其他相關(guān)文獻來看[8-9]，在劑量更高、時間更長的情況下，抗氧化酶類和氧化反應(yīng)產(chǎn)物都有顯著性改變，提示低劑量下氧化反應(yīng)產(chǎn)物變化可能早于抗氧化酶類，表現(xiàn)更靈敏。內(nèi)源性血脂主要是在機體的肝臟、脂肪等組織細胞合成，血脂作為評價脂代謝功能的重要指標，可以反映肝臟的代謝功能。從本次實驗的血脂結(jié)果來看，各處理組的CHO差異無統(tǒng)計學(xué)意義，無主效應(yīng)及交互作用。TG表現(xiàn)為苯不同劑量組變化不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低劑量聯(lián)合染毒顯示TG升高較明顯，但各聯(lián)合染毒組均低于低劑量苯組，說明該劑量下的苯對小鼠TG的影響要高于甲醛，聯(lián)合染毒時甲醛的暴露抵消了苯對TG的影響。

綜上所述，低濃度、短時間的苯和甲醛聯(lián)合暴露對ICR小鼠的體重增長有影響，存在系統(tǒng)毒性，結(jié)合AST、TG、MDA的變化來看，可以推測該劑量下的暴露可導(dǎo)致肝臟等多種臟器的損傷。從動物實驗結(jié)果來看，苯的肝臟毒性更明顯，多個指標在苯不同劑量組有差異，提示目前苯的PC-STEL值接近健康損害閾值，存在一定風險。苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合毒效應(yīng)增強，高劑量聯(lián)合毒效應(yīng)降低，有可能是低劑量的聯(lián)合暴露導(dǎo)致動物的低劑量保護效應(yīng)，各項指標都代償性升高，但考慮到樣本量和實驗的穩(wěn)定性，其交互作用具體為拮抗還是協(xié)同作用有待進一步研究。