黃鈾新，孟祥磊，張敏鴻，羅耀玲，李 杰△

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1核醫(yī)學(xué)科，2呼吸內(nèi)科，3臨床科研中心，江西贛州341000）

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于其它腫瘤之首[1-2]。肺癌的早期臨床表現(xiàn)不典型，早期診斷率較低[1-2]?；蛲蛔兪菍?dǎo)致肺癌發(fā)生的一個重要因素，雖然目前已觀察到諸多生物標(biāo)志物，如RECQL4（RecQ protein-like 4）、FOXM1（forkhead box M1）等[3-4]與肺癌發(fā)病相關(guān)，但仍不能滿足臨床上肺癌早期診斷需求，故仍需對肺癌進(jìn)行探索以尋找肺癌診斷標(biāo)志物及治療靶點，利于肺癌的早期診斷、早期治療和降低肺癌患者的死亡率。

含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的NOD樣受體家族蛋白3（NOD-like receptor family caspase recruitment domain containing 3，NLRC3）是NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）家族的一員，由位于16p13.3染色體的NLRC3基因所編碼，是胞質(zhì)內(nèi)固有的免疫調(diào)節(jié)因子，能夠抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）控制的主要炎癥通路[5]。在結(jié)腸癌和肝癌中的研究顯示，NLRC3有抑癌作用，是預(yù)測和治療腫瘤的潛在腫瘤標(biāo)志物和新靶點[4-5]。然而NLRC3是否在肺癌發(fā)生中起作用，目前尚不清楚。本研究擬通過小片段干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)，敲減NLRC3在人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，觀察細(xì)胞活力和凋亡的變化，并初步探索NLRC3參與調(diào)控肺癌發(fā)生的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

BEAS-2B細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自GIBCO；Lipofectamine? 2000和TRIzol購自Invitrogen；熒光定量PCR試劑盒購自BIO-RAD；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；JC-1和annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自BD；β-actin、Bcl-2和Bax抗體及II抗購自中杉金橋公司；3條NLRC3siRNA片段（分別記為siNLRC3-1、siNLRC3-2和siNLRC3-3）及陰性對照序列（negative control siRNA，siNC）由生工生物（上海）股份有限公司設(shè)計合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁生長，后續(xù)實驗所用細(xì)胞均是取自處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上。

2.2 BEAS-2B細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染及最佳干擾片段的篩選 按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染操作說明書將熒光標(biāo)記的FAM-siRNA片段按照不同比例轉(zhuǎn)染于6孔板中BEAS-2B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

為篩選最佳干擾片段，將細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染（untransfected，UT）組、siNC組、siNLRC3-1組、siNLRC3-2組和siNLRC3-3組。各實驗組均取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，計數(shù)，按每孔1.5×105個細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%后開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，并通過紫外分光光度儀測定濃度及純度。

將各組總RNA濃度調(diào)一致后，按照TaKaRa的PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指導(dǎo)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作，熒光定量PCR驗證3條干擾片段的干擾效果，挑選最佳干擾片段。NLRC3的上游引物序列為5'-GACATGAAGGCGTTTGGTGT-3'，下游引物序列為5'-GCCATAGTAATACGCGGCTG-3'，產(chǎn)物長度為153 bp。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5'-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3'，下游引物序列為5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，產(chǎn)物長度為 320 bp。PCR條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s并收集熒光，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用相對定量法，以 2-ΔΔCt來進(jìn)行分析，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參照，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

2.3 MTT法檢測3個干擾片段對BEAS-2B細(xì)胞的活力影響 胰酶消化對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，計數(shù)并按每孔4×103個來接種96孔培養(yǎng)板，待過夜培養(yǎng)貼壁后以siNLRC3∶Lipofectamine?2000為0.25 μL∶0.25 μL的量進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，UT組用PBS處理，轉(zhuǎn)染6 h后更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后小心吸去孔內(nèi)液體，然后每孔加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min使結(jié)晶物充分融解，隨后用酶標(biāo)儀于570 nm波長測定各孔吸光度（A570）。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞相對活力（%）=干擾組A570/UT組A570×100%。

2.4 JC-1檢測線粒體膜電位 將細(xì)胞分為3組：UT組、siNC組和siNLRC3-3組。取對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，按每孔1.5×105接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)50%后開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后收集各組的細(xì)胞，計數(shù)；再用PBS洗滌2次，重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×109L。從中取細(xì)胞懸液100 mg/L加入流式管，加入終濃度為10 mg/L的JC-1，37℃溫育30 min，然后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.5 annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率 實驗分組、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前JC-1實驗。收集轉(zhuǎn)染24 h后的各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，4℃、192×g離心 5 min，用 1×Binding Buffer調(diào)整濃度1×109/L；從中取細(xì)胞懸液100 μL（1×105個細(xì)胞）加入流式管，并向管中加入5 μL annexin V-FITC，輕輕搖勻后避光室溫孵育10 min，再于管中加入5 μL PI，室溫下避光孵育15 min；孵育結(jié)束后向管內(nèi)添加400 μL 1×Binding Buffer，輕輕搖勻后1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。計算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

2.6 Western blot檢測敲減NLRC3表達(dá)對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 實驗分組、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)液并用1×PBS洗滌3遍，隨后置冰上用RIPA裂解液（用前加入PMSF，終濃度為1 mmol/L）充分裂解各組細(xì)胞30 min，繼之以4℃、16 400×g離心5 min，上清液即是總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白量；每組蛋白上樣30 μg；SDS-PAGE分離蛋白后切取目的蛋白凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)PVDF膜；后經(jīng)封閉、I抗孵育、洗膜、II抗孵育、洗膜、ECL發(fā)光等步驟，在Bio-Rad凝膠成像儀上成像，并將條帶進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示；多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率

FAM-siNC轉(zhuǎn)染6 h后，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染比例100 pmol∶5 μL組發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞約占觀察視野下細(xì)胞總數(shù)的90%以上，且細(xì)胞生長狀態(tài)良好，見圖1。

Figure 1.The transfection efficiency（6 h after FAM-siNC transfection）observed under fluorescence inverted microscope（scale bar=100 μm）.A：bright field image；B：fluorescence field image.After transfection，the cells grew well with normal shape，and 90 percentage of the cells were stained.圖1 FAM-siNC轉(zhuǎn)染6 h后觀察轉(zhuǎn)染效果

2 RT-qPCR篩選干擾片段

RT-qPCR結(jié)果顯示，UT組、siNC組和siNLRC3-2組NLRC3 mRNA的表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）；siNLRC3-1組NLRC3 mRNA的表達(dá)水平顯著低于 UT組（P＜0.05）；與UT組比較，siNLRC3-3組NLRC3 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Comparison of the interference effects of the 3 interference segments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs UT group.圖2 3個干擾片段干擾效果的比較

3 MTT法檢測敲減NLRC3對BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測3個干擾片段轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的活力，進(jìn)一步驗證干擾片段的干擾效果。結(jié)果顯示，與UT組相比，siNC組和siNLRC3-2組細(xì)胞活力無顯著差異（P＞0.05）；siNLRC3-1組和siNLRC3-3組細(xì)胞活力與UT組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖3。結(jié)合RT-qPCR篩選結(jié)果和MTT結(jié)果，我們認(rèn)為siNLRC3-3片段具有較好的干擾效果，可用于后續(xù)實驗。

Figure 3.The effect of NLRC3 knock-down on viability of BEAS-2B cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs UT group.圖3 敲減NLRC3基因?qū)EAS-2B細(xì)胞活力的影響

4 敲減NLRC3對BEAS-2B細(xì)胞線粒體膜電位的影響

采用JC-1熒光探針和流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位，R2門代表正常細(xì)胞，R3門代表凋亡細(xì)胞，R2/R3比值增加表示線粒體膜電位升高，早期細(xì)胞凋亡減少。結(jié)果顯示，siNLRC3-3組的R2/R3與UT組和siNC組相比顯著增加（P＜0.05），見圖4及表1。

Figure 4.The mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry with JC-1 staining.圖4 JC-1和流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位

表1 線粒體膜電位變化的比較Table 1.Comparison ofmitochondrialmembrane potential changes（n=3）

5 敲減NLRC3對BEAS-2B細(xì)胞凋亡的影響

采用annexin V/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，siNLRC3-3組凋亡率與UT組和siNC組相比顯著下降（P＜0.05），而siNC組和UT組的細(xì)胞凋亡率相比無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

6 Western blot檢測敲減NLRC3對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與UT組和siNC組相比，siNLRC3-3組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Bax蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖6。

Figure 5.The effect of NLRC3 knock-down on apoptosis of BEAS-2B cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs UT group.圖5 敲減NLRC3對BEAS-2B細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.The effect of NLRC3 knock-down on the protein expression levels of Bcl-2 and Bax.Mean±SD.n=3.#P＜0.01 vs UT group.圖6 敲減NLRC3對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

NLRC3又稱NOD3、CLR16.2，屬于NLRs家族成員[6-8]，在結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌組織中顯著低表達(dá)[9-10]。已有研究表明，NLRC3在調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等病理生理過程中起重要作用[7，11-14]。

本研究探索了NLRC3在肺癌發(fā)生中的作用。MTT檢測結(jié)果表明，敲減NLRC3后BEAS-2B細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，與Ma等[10]和Zha等[14]所觀察到的低表達(dá)NLRC3對細(xì)胞增殖影響的結(jié)果相一致。腫瘤的特征之一是增殖能力增強(qiáng)[15-16]，因此我們推測NLRC3低表達(dá)可能是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。同時細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，NLRC3低表達(dá)后線粒體膜電位顯著升高，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)減少。線粒體跨膜電位下降是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件[17-18]。脂質(zhì)熒光探針JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。JC-1在線粒體膜電位較高時為聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在膜電位較低時為單體，產(chǎn)生綠色熒光[19-20]。通過JC-1熒光顏色的轉(zhuǎn)變很容易地檢測到線粒體膜電位的變化。根據(jù)本實驗結(jié)果結(jié)合既往研究推測NLRC3可通過內(nèi)源性線粒體凋亡途徑調(diào)節(jié)BEAS-2B細(xì)胞凋亡/增殖平衡，當(dāng)NLRC3低表達(dá)后其在細(xì)胞凋亡信號網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)作用減弱，最終導(dǎo)致凋亡/增殖失衡。既往研究表明，NLRC3在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程中起一定的作用，我們觀察到在BEAS-2B細(xì)胞中敲減NLRC3可導(dǎo)致細(xì)胞活力、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變，提示NLRC3低表達(dá)可能在肺癌起始過程中發(fā)揮作用，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

基因表達(dá)異常引起腫瘤發(fā)生往往涉及到凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)改變，因此我們進(jìn)一步在蛋白分子水平探索NLRC3低表達(dá)后引起凋亡/增殖失衡的機(jī)制，Western blot結(jié)果顯示，敲減NLRC3后Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，而Bax蛋白表達(dá)下調(diào)。Rezaei等[21]的研究顯示，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)并過表達(dá)Bax蛋白，上調(diào)Bax/Bcl-2比例，能夠誘導(dǎo)HepG2和L929細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白家族是線粒體膜蛋白，其中Bcl-2蛋白是重要的抗調(diào)亡蛋白[22]，而Bax蛋白是重要的促凋亡蛋白[23]，Bcl-2/Bax被認(rèn)為是啟動細(xì)胞凋亡的分子開關(guān)[24-26]，參與內(nèi)源性線粒體凋亡信號通路的調(diào)控。內(nèi)源性線粒體凋亡信號通路活化可引起線粒體因子（如細(xì)胞色素C）釋放，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease-activating factor 1，APAF-1）、caspases-9形成凋亡小體并被活化，最終啟動細(xì)胞凋亡，參與并維持細(xì)胞凋亡與增殖平衡。由此可推測，Bcl-2和Bax蛋白可能是NLRC3的調(diào)節(jié)靶點，影響凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達(dá)可能是低表達(dá)NLRC3影響B(tài)EAS-2B細(xì)胞生長、增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的方式之一。

本研究表明，敲減NLRC3表達(dá)能夠?qū)cl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生影響，但我們?nèi)匀徊磺宄﨨LRC3是通過直接還是間接的作用方式影響B(tài)cl-2和Bax蛋白表達(dá)及與它們相互作用的方式。此外，由于信號網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，其中所涉及的作用機(jī)制及信號通路也不清楚。

綜上所述，本研究證實了敲減NLRC3表達(dá)可抑制BEAS-2B細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活力。本研究揭示了NLRC3低表達(dá)可能是引起肺癌發(fā)生的一個關(guān)鍵因素，同時也提示NLRC3低表達(dá)可能是肺癌的潛在腫瘤標(biāo)志物和潛在治療靶點。但由于實驗的局限性，探索還不夠十分深入和廣泛，需要后期從蛋白質(zhì)組學(xué)、動物體內(nèi)實驗和臨床水平實驗進(jìn)一步探索。