于 飛，田 華，盧 珊，郭亞新，王曉旭，，焦 鵬，宗傳龍，姚樹(shù)桐，△，秦樹(shù)存△

[山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安27100]

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種細(xì)胞介導(dǎo)下的慢性炎癥性病理過(guò)程，作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類的健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等均參與AS的發(fā)生發(fā)展，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡是AS發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于AS的防治具有重要意義[1]。有研究表明，攝入富含黃酮類食物的量與AS的發(fā)生率和死亡率呈負(fù)相關(guān)，其中蜂膠黃酮具有廣泛的抗AS功能[2]。

喬松素（pinocembrin）是一種存在于植物和蜂膠中含量較高的黃酮類天然化合物，具有抗菌、抗原蟲(chóng)、抗氧化、抗凋亡等多種藥理學(xué)活性。另有研究表明，辛伐他汀和喬松素聯(lián)合治療ApoE-/-小鼠14周可顯著降低小鼠血清脂質(zhì)水平，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕AS病變，并且聯(lián)合療法的療效優(yōu)于單用辛伐他汀[3]，且單獨(dú)應(yīng)用喬松素可使ApoE-/-小鼠AS斑塊面積縮小，降低血清中和斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的水平，并具有防止斑塊破裂和穩(wěn)定斑塊的作用[4]。喬松素可減輕脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制核因子κB p65活化有關(guān)[5]。大量研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）信號(hào)途徑介導(dǎo)AS的發(fā)生發(fā)展尤其是易損性斑塊的形成[6-8]。ERS凋亡途徑在棕櫚酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中具有重要作用[9-10]。本課題組既往研究證實(shí)，蜂膠醇提物可通過(guò)抑制ERS凋亡途徑關(guān)鍵分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達(dá)減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]，但是蜂膠醇提物中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的有效成分及其調(diào)控CHOP的上游分子機(jī)制尚未被完全闡明。本研究在ERS誘導(dǎo)劑衣霉素（tunicamycin，TM）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs）損傷模型上，探討喬松素對(duì)CHOP表達(dá)、CHOP上游調(diào)控蛋白——蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）磷酸化水平及活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）核轉(zhuǎn)位的影響，以進(jìn)一步明確蜂膠黃酮抗AS的有效成分并深入探討其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

喬松素、TM和小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自Sigma；MTT購(gòu)自 Genview；Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測(cè)定試劑盒和Hoechst 33342/PI雙染試劑盒分別購(gòu)自南京凱基和南京建成公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Solarbio；兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、ATF6、p-PERK、p-eIF2α 和CHOP多克隆抗體及AlexaFluor 488標(biāo)記的驢抗兔II抗購(gòu)自Cell Signaling Technology、Sigma和Invitrogen；DAPI和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗分別購(gòu)自上海碧云天和北京中杉金橋公司；ECL試劑盒和PVDF膜分別購(gòu)自Pierce和Millpore。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供，用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS+1×105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素）在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理前換無(wú)血清培養(yǎng)液同步化12 h，然后參照文獻(xiàn)報(bào)道及本課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分為如下3組：（1）正常對(duì)照（control）組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；（2）TM組：培養(yǎng)液中加入10 mg/L的TM[12]；（3）喬松素干預(yù)（pinocembrin）組：分別在培養(yǎng)液中先加入6.25、12.5、25 和 50 mg/L[13]喬松素預(yù)處理 1 h，再加入 10 mg/L的TM。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的測(cè)定 接種于96孔板的細(xì)胞按照上述分組處理后，按既往報(bào)道的MTT法[13]檢測(cè)細(xì)胞活力。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度（A）值占對(duì)照組A值的百分比表示。培養(yǎng)液中LDH活性檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2.3 Hoechst 33342/PI雙染色熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞死亡情況 接種細(xì)胞于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，經(jīng)處理后吸棄培養(yǎng)液，將100倍稀釋的Hoechst 33342染色液加到細(xì)胞爬片上，37℃避光孵育15 min；PBS潤(rùn)洗后將200倍稀釋的PI染色液加到爬片上，室溫避光孵育10 min；PBS潤(rùn)洗后抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡（Olympus）下觀察（Hoechst 33342激發(fā)光波長(zhǎng)352 nm，呈藍(lán)色；PI激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，呈紅色）。PI陽(yáng)性率（%）=紅色細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)相應(yīng)處理后，用胰酶消化，100×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞并重懸于500 μL上樣緩沖液中，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕微搖勻后，室溫避光孵育15 min，隨即在流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）上檢測(cè)?？偧?xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡率（Annexin+/PI－）+晚期凋亡率（Annexin+/PI+）。

2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ATF6核轉(zhuǎn)位情況 細(xì)胞接種于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，處理后經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS潤(rùn)洗后以0.1%Triton X-100室溫透化5 min，以10%驢血清封閉30 min，滴加兔抗人ATF6抗體（1∶100），4℃孵育過(guò)夜，PBS潤(rùn)洗后滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶500），37℃避光孵育30 min，再以DAPI復(fù)染細(xì)胞核（藍(lán)色）5 min，PBS充分潤(rùn)洗后以抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，ATF6呈綠色。

2.6 Western blot分析 采用RIPA試劑提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度一致后進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后室溫封閉，分別加入兔抗 p-PERK（1∶200）、p-eIF2α（1∶200）、GRP78（1∶500）和CHOP（1∶500）多克隆抗體及小鼠抗β-actin（1∶1 000）多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入Ⅱ抗（1∶2 000）孵育2 h，經(jīng)化學(xué)顯色底物ECL進(jìn)行發(fā)光顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件（Version 6.0，Media Cybernetics）分析蛋白條帶積分吸光度（integral absorbance，IA），以靶蛋白IA/β-actinIA的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 喬松素抑制TM所致的HUVECs活力降低

用 6.25、12.5、25和 50 mg/L的喬松素處理HUVECs 24 h，與正常對(duì)照組相比，6.25、12.5和25 mg/L喬松素處理組細(xì)胞活力無(wú)顯著改變（P＞0.05），而50 mg/L喬松素處理組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），表明劑量為6.25～25 mg/L的喬松素對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，見(jiàn)圖1A。與對(duì)照組相比，TM處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），然而給予喬松素預(yù)處理1 h，細(xì)胞活力較TM組顯著增加，尤其以12.5和25 mg/L喬松素處理組更為顯著（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

2 喬松素抑制TM所致的HUVECs膜損傷

TM組細(xì)胞LDH漏出顯著增加（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預(yù)處理組LDH漏出較TM組顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖 2A。Hoechst 33342/PI雙染法觀察細(xì)胞形態(tài)，TM組細(xì)胞膜通透性增加甚至破裂，從而允許PI穿過(guò)細(xì)胞膜至核內(nèi)與DNA結(jié)合，細(xì)胞核紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞增加（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預(yù)處理組細(xì)胞膜損傷減輕，表現(xiàn)為細(xì)胞核紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。

3 喬松素減輕TM所致的HUVECs凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，TM組細(xì)胞凋亡率顯著增加，為對(duì)照組的4.3倍（P＜0.01）；與TM組比較，12.5和25 mg/L的喬松素預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別降低15.3%和22.1%（P＜0.05和P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 喬松素抑制TM所誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)GRP78和CHOP上調(diào)

與對(duì)照組相比，TM組GRP78和CHOP表達(dá)顯著升高（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預(yù)處理可顯著抑制TM所誘導(dǎo)的GRP78和CHOP上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖4。

5 喬松素抑制TM所致的HUVECs內(nèi)ATF6核轉(zhuǎn)位

Figure 2.Effect of pinocembrin on TM-induced membrane damage in HUVECs.The cells were pretreated with the indicated doses of pinocembrin for 1 h，and then stimulated with TM（10 mg/L）for 24 h.The degree of cell membrane damage was determined by LDH activity in media（A）and Hoechst 33342（blue）/PI（red）double-staining assay（B）.Images were captured using a laser scanning confocal microscope，and PI-positive cells in 5 randomly chosen fields each containing about 100 cells were quantified（scale bar=20 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TM group.圖2 喬松素對(duì)TM所致的HUVECs膜損傷的影響

采用免疫熒光染色法顯示ATF6核轉(zhuǎn)位情況，對(duì)照組綠色熒光主要分布于細(xì)胞漿，而核內(nèi)很少或者無(wú)表達(dá)；TM組細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光染色；而與TM組相比，喬松素（12.5和25mg/L）預(yù)處理組的細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度顯著降低，見(jiàn)圖5。

Figure 3.Effect of pinocembrin on TM-induced apoptosis of HUVECs.The cells were pretreated with 12.5 and 25 mg/L of pinocembrin for 1 h，and then treated with TM（10 mg/L）for 24 h.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining，and the total apoptotic rates（early-and late-stage apoptosis）were calculated.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖3 喬松素對(duì)TM所致HUVECs凋亡的影響

Figure 4.Effect of pinocembrin on the protein expression of GRP78 and CHOP in TM-treated HUVECs.The cells were treated as described in Figure 3.The protein expression levels of GRP78 and CHOP were detected by Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖4 喬松素對(duì)TM所致的HUVECs內(nèi)GRP78和CHOP表達(dá)的影響

6 喬松素抑制TM所致的HUVECs內(nèi)PERK和eIF2α磷酸化

與對(duì)照組相比，TM處理組p-PERK和p-eIF2α水平顯著升高（P＜0.01），而喬松素（12.5和25 mg/L）預(yù)處理可顯著減輕PERK和eIF2α的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖6。

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能紊亂是AS發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，ox-LDL、晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）和異常血流剪切應(yīng)力等多種病理性致AS因素均可誘導(dǎo)ERS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此減輕ERS介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是AS防治的重要措施[14-16]。既往對(duì)喬松素的研究表明，其具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[17]。對(duì)于心血管疾病的研究表明喬松素可使ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積縮小，也可降低血清中和斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及內(nèi)皮素的水平，對(duì)斑塊產(chǎn)生有抑制作用，同時(shí)還具有防止斑塊破裂和穩(wěn)定斑塊的作用[3-4]，但其具體細(xì)胞分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。本研究結(jié)果顯示，給予ERS誘導(dǎo)劑TM處理HUVECs 24 h，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞膜損傷程度和凋亡率顯著增加，與文獻(xiàn)報(bào)道[12，18]一致。而給予喬松素預(yù)處理可顯著抑制TM所誘導(dǎo)的HUVECs損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加，細(xì)胞膜損傷程度和凋亡率降低，且呈濃度依賴性。這些結(jié)果提示喬松素可減輕HUVECs損傷，其機(jī)制可能與抑制ERS介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。

Figure 5.Effect of pinocembrin on ATF6 nuclear translocation in HUVECs induced by TM.The cells were treated as described in Figure 3.Immunofluorescence experiments showed ATF6 visualized by Alexa Fluor 488（green）and nuclei stained with DAPI（blue）.The representative fluorescence images were captured by a laser scanning confocal microscope（scale bar=20 μm）.圖5 喬松素對(duì)TM所致HUVECs內(nèi)ATF6核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 6.Influence of pinocembrin on the phosphorylation levels of PERK and eIF2α in TM-treated HUVECs.The cells were treated as described in Figure 3.The protein levels of p-PERK and p-eIF2α were detected by Western blot.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TM group.圖6 喬松素對(duì)TM所致的HUVECs內(nèi)PERK和eIF2α磷酸化水平的影響

既往研究證實(shí)，抑制炎癥反應(yīng)是喬松素發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的重要機(jī)制。喬松素在脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中可抑制核因子κB以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38絲裂原激活蛋白激酶的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10等細(xì)胞因子的分泌[19]。蜂膠醇提物和喬松素均可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和基質(zhì)金屬蛋白酶9基因表達(dá)及活性[20]。另有研究表明喬松素可通過(guò)抑制核因子κB和p38絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥因子的釋放減輕脂多糖和ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡[5，21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是損傷感知或凋亡信號(hào)整合的主要位點(diǎn)，且過(guò)度的ERS可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。CHOP又稱生長(zhǎng)停滯和DNA損傷蛋白153，是介導(dǎo)ERS相關(guān)凋亡途徑的關(guān)鍵分子之一[22]。CHOP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡參與AS進(jìn)展尤其是不穩(wěn)定AS粥樣斑塊的形成[23-24]。本課題組前期工作證實(shí)ox-LDL、氧化和糖基化高密度脂蛋白均可通過(guò)激活CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[25-27]，而蜂膠提取物及其黃酮單體槲皮素可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，下調(diào)CHOP表達(dá)從而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11，28-29]，這些結(jié)果表明CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑參與AS發(fā)生發(fā)展，并可能成為AS防治靶點(diǎn)，但是喬松素對(duì)CHOP介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是否具有抑制作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ERS誘導(dǎo)劑TM可上調(diào)HUVECs內(nèi)ERS標(biāo)志分子GRP78和促凋亡蛋白CHOP的表達(dá)水平，而喬松素可顯著拮抗兩者的上調(diào)，表明喬松素可通過(guò)抑制CHOP信號(hào)通路減輕HUVECs凋亡。

CHOP主要受PERK-eIF2α-ATF4通路調(diào)控，也可被ATF6和肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IREl）上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平[22]。本課題組前期工作證實(shí)PERK和ATF6可介導(dǎo)ox-LDL和氧化高密度脂蛋白所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[25，27]，而蜂膠醇提物可通過(guò)抑制PERK-eIF2α-CHOP信號(hào)通路減輕ox-LDL和TM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TM處理組可上調(diào)PERK和eIF2α的磷酸化以及ATF6核轉(zhuǎn)位，而喬松素則顯著逆轉(zhuǎn)TM所致的上述變化，并呈劑量依賴性，說(shuō)明喬松素可以通過(guò)抑制PERK-eIF2α和ATF6這兩條ERS信號(hào)通路的激活來(lái)降低CHOP的表達(dá)，從而減少TM所致的HUVECs凋亡。

綜上所述，本研究顯示喬松素可減輕ERS所介導(dǎo)的HUVECs凋亡，其機(jī)制可能與抑制PERK-eIF2α和ATF6信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)CHOP表達(dá)有關(guān)。但鑒于本工作是以HUVECs為研究對(duì)象的體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，與臨床人體疾病的復(fù)雜性有著很大的區(qū)別，因此有關(guān)喬松素等黃酮類化合物抗AS的臨床研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。