姚小琳，張濤，江波

(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學)， 江蘇 無錫， 214122)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)是一種典型的淀粉水解酶，該酶的主要工業(yè)應(yīng)用價值在于其高效的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，CGTase的3種轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)包括環(huán)化、耦合、歧化，其活性均顯著高于水解反應(yīng)[1]，該酶的獨特之處在于其可以通過環(huán)化反應(yīng)將淀粉或淀粉類似物轉(zhuǎn)化為非還原性環(huán)狀麥芽寡糖[2]。常見的環(huán)狀麥芽寡糖為含有6、7、8個葡萄糖單元的分子，分別為α-環(huán)糊精(α-cyclodextrin，α-CD)、β-CD和γ-CD[3-5]。環(huán)糊精分子為外部親水內(nèi)部疏水的中空圓筒形立體結(jié)構(gòu)，這使得環(huán)糊精能與很多特定大小的疏水性分子或基團形成穩(wěn)定的包合物，從而改變客體分子的理化性質(zhì)，因此環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、化妝品等很多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[6-7]。隨著環(huán)糊精的廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)環(huán)糊精的CGT酶的制備已成為當今研究的熱點[8]。目前，已發(fā)現(xiàn)的能分泌CGT酶的微生物種類很多，大多數(shù)為芽孢桿菌屬。但通常野生菌所產(chǎn)CGT酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率較低，這與酶的菌種來源以及反應(yīng)條件相關(guān)；包括底物的種類、濃度、加酶量、反應(yīng)溫度及pH等條件[9]。很多研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件來提高菌種產(chǎn)酶能力，但由于野生菌本身的調(diào)控機制存在很多限制；為了提高菌種的產(chǎn)酶量，可以采用基因工程的手段將CGTase進行異源表達[10]。

目前，只有β-CD實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，但其原料的轉(zhuǎn)化率局限在50%～60%，其他2種環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率則更低[11]。本研究將來自于PaenibacilluscampinasensisSK13. 001的β-CGTase基因連接到大腸桿菌表達載體pET-22b(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-22b(+)/β-CGT，將其轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliBL21(DE3)中，并進行搖瓶發(fā)酵，測定菌體沉淀中β-CGTase的環(huán)化活力，并對該酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精的工藝條件進行優(yōu)化，獲得了高效生產(chǎn)環(huán)糊精的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

PaenibacilluscampinasensisSK13.001，保藏于本實驗室；克隆宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、表達宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)，生工生物工程(上海)股份有限公司；表達質(zhì)粒pET-22b(+)，本實驗室保藏。

1.2 試劑及儀器

可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、酵母提取物，胰蛋白胨，國藥集團；基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR引物，由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成；工具酶，TaKaRa(大連)生物有限公司；標準α，β，γ-環(huán)糊精，Sigma(上海)公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

A360紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HS-800D電熱恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學儀器廠；GL-10MD高速臺式大容量離心機，湖南湘儀集團；高速冷凍離心機，美國Eppendorf有限公司；e2695高效液相色譜儀、RID-10A示差折光檢測器，美國沃特世公司；Agilent ZORBAX NH2色譜柱(5 μm, 4.2 mm×250 mm)，美國安捷倫公司；蛋白電泳儀、核酸電泳儀、PCR儀，德國伯樂公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10；LB固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基添加10～15 g/L瓊脂粉。

TB培養(yǎng)基(g/L)：甘油4，胰蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO4·3H2O 16.4，KH2PO42.3。

1.4 實驗方法

1.4.1 重組質(zhì)粒pET-22b(+)的構(gòu)建與篩選

提取PaenibacilluscampinasensisSK13.001的全基因組DNA，并以此為模板設(shè)計引物PCR得到β-CGTase(包括信號肽)目的片段。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 120 s，循環(huán)34次，72 ℃ 5 min；PCR引物如下：F1(5′-3′): CGCCCATGGATGAAAAGATTTATGAAACTAACAGCCG(正向引物)，R1(5′-3′)：CCCTCGAGAGGCTGCCAGTTCACATT(反向引物)。2條引物均在酶切位點前加入保護堿基以方便質(zhì)粒構(gòu)建。F1,R1分別含有NcoI和XhoI的限制性酶切位點；以F1,R1為引物PCR擴增得到β-CGTase目的片段，將其純化、回收后采用酶切位點雙酶切、酶連的方法連接到含有6個組氨酸標簽的大腸桿菌表達載體pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)/β-CGT，轉(zhuǎn)化到克隆宿主大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆子并接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒pET-22b(+)/β-CGT進行PCR雙酶切驗證和測序鑒定。

1.4.2 β-CGTase的誘導表達及鑒定

將驗證成功的重組質(zhì)粒pET-22b(+)/β-CGT轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，pET-22b(+)空質(zhì)粒處理同上作為對照，涂布LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆子。將鑒定正確的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，添加適量的氨芐青霉素，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h,以2%接種量接種于50 mL TB培養(yǎng)基中，加入適量的氨芐青霉素，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為0.9 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25 ℃誘導培養(yǎng)34 h，離心收集菌體，加入裂解液超聲破碎后收集上清，上清液經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroresis，SDS-PAGE)進行蛋白表達鑒定。SDS-PAGE參照LAEMMLI[12]的方法。

1.4.3 β-CGTase的分離純化

將菌體沉淀破碎，離心得到的上清液即為粗酶液。粗酶液參照七海生物Ni-NTA親和層析柱說明書進一步分離純化，得到純化的β-CGTase，將純化后的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE進行蛋白表達鑒定。

1.4.4 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化活力的測定及轉(zhuǎn)化率的計算

β-CGTase活性主要指環(huán)化活力。測定方法為用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制質(zhì)量濃度10 g/L淀粉，加熱糊化，降溫至55 ℃，加入適量的粗酶液，反應(yīng)10 min，煮沸滅酶，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定環(huán)糊精含量。單位酶活力(U)定義為1 min生成1 μmol環(huán)糊精所需要的酶量。

HPLC色譜條件：Agilent ZORBAX NH2色譜柱；示差折光檢測器(RID-10A)；流動相為體積分數(shù)為65%的乙腈水溶液；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL。

環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率如公式(1)所示：

(1)

1.4.5 重組β-CGTase反應(yīng)條件優(yōu)化

1.4.5.1 底物種類對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制不同種類的質(zhì)量濃度為30 g/L的底物，包括玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、木薯淀粉，將底物溶液煮沸糊化并不斷攪拌，降溫后加入3 U/g干淀粉的酶液，55 ℃反應(yīng)8 h后，沸水浴滅酶，反應(yīng)液12 000 r/min，離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，HPLC檢測產(chǎn)物含量并計算轉(zhuǎn)化率。

1.4.5.2 底物質(zhì)量濃度對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)配制質(zhì)量濃度為30、50、70、100 g/L的玉米淀粉，將溶液煮沸糊化并不斷攪拌，降溫后加入3 U/g干淀粉的酶液，55 ℃反應(yīng)8 h后,沸水浴滅酶，樣品處理同 1.4.5.1。

1.4.5.3 加酶量對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制質(zhì)量濃度為30 g/L的玉米淀粉，將淀粉溶液煮沸糊化并不斷攪拌，降溫后分別加入1、3、5、7、10 U/g淀粉的酶液，55 ℃反應(yīng)8 h后，沸水浴滅酶，樣品處理同1.4.5.1。

1.4.5.4 反應(yīng)時間對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制3%的玉米淀粉，將淀粉溶液煮沸糊化并不斷攪拌，降溫后加入5 U/g干淀粉的酶液，55 ℃下反應(yīng),間隔時間取樣，沸水浴滅酶，樣品處理同1.4.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌BL21/pET-CGT的構(gòu)建與表達

以來源于PaenibacilluscampinasensisSK13. 001的基因組DNA為模板，PCR擴增得到成熟的CGTase片段，如圖1-A所示，長度大小為2 kb左右，將CGTase基因片段采用酶切位點雙酶切、酶連的方法連接到表達載體pET-22b(+)中，轉(zhuǎn)化克隆宿主大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆子，提質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1-B所示，重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI兩個酶切位點進行雙酶切驗證，顯示2條明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期相符，證明β-CGTase基因成功連接到表達載體pET-22b(+)上。

A-基因組DNA的PCR產(chǎn)物；B-重組質(zhì)粒的雙酶切驗證
圖1 目的片段的PCR結(jié)果及重組質(zhì)粒的酶切驗證
Fig.1 PCR results of target fragments and verification of recombinant plasmid digestion

將連接成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)后，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液上清液以及菌體沉淀中的酶活，發(fā)現(xiàn)上清液中環(huán)化活性較低，菌體沉淀破碎后上清液有較高酶活，從圖2可以看出隨著發(fā)酵時間的延長，β-CGTase的環(huán)化活力逐漸升高，當誘導培養(yǎng)時間為34 h時，環(huán)化活力達到15 U/mL，所以誘導培養(yǎng)時間為34 h。

圖2 重組菌酶活隨時間變化
Fig.2 Recombinant enzyme activity changes over time

圖3為重組大腸桿菌BL21/pET-CGT蛋白表達的SDS-PAGE圖，觀察到目的蛋白條帶,預(yù)測目的蛋白分子質(zhì)量為70 kDa。大多數(shù)報道的CGT酶是單體蛋白，分子質(zhì)量在33～110 kDa[13]；本實驗得到的CGT酶的分子質(zhì)量與同物種的其他菌株分子質(zhì)量相似[14]。

M-蛋白Marker；1-發(fā)酵胞內(nèi)上清液蛋白條帶;2-純化后的蛋白
圖3 重組菌產(chǎn)酶SDS-PAGE
Fig.3 Recombinant bacteria producing SDS-PAGE

2.2 重組β-CGTase反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 底物種類對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

由圖4可知，不同淀粉類型對環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率有所不同。當反應(yīng)作用底物為玉米淀粉時，環(huán)糊精的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率最高為36%，馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、木薯淀粉分別為33%、30%、28%。產(chǎn)物中3種環(huán)糊精的比例為α∶β∶γ=7∶75∶18。酶法生產(chǎn)環(huán)糊精通常以淀粉作為底物，淀粉由直鏈和支鏈淀粉組成，不同種類的淀粉中直鏈和支鏈淀粉的比例有所不同，所以環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率不盡相同，在實際生產(chǎn)中根據(jù)不同的情況選擇合適的底物[15]。

圖4 不同種類淀粉對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響
Fig.4 Effect of different types of starch on cyclodextrin yield

2.2.2 底物質(zhì)量濃度對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

由圖5可知，底物濃度對環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率有很大的影響，隨著底物質(zhì)量濃度的升高，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率逐漸下降。當玉米淀粉質(zhì)量濃度為30 g/L，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率最高為36%；隨著底物質(zhì)量分數(shù)升高，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率迅速下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能有：隨著底物質(zhì)量分數(shù)的升高，加熱糊化后淀粉的黏度變大，使得底物與酶蛋白無法充分的接觸，導致反應(yīng)速率下降；其次是酶與底物的結(jié)合逐漸達到飽和，較高的底物濃度對酶與底物的反應(yīng)不會有促進作用，此外，較高的底物濃度可能會使酶反應(yīng)所得產(chǎn)物中小分子糖含量升高，而這些小分子糖會抑制CGTase的環(huán)化作用，而增強其耦合作用，從而降低環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率[9]。

圖5 底物濃度對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響
Fig.5 Effect of substrate concentration on cyclodextrin yield

2.2.3 加酶量對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

由表1可知，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨加酶量的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當CGTase的添加量為5 U/g淀粉時，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率最高為45.63%，其中β-CD的轉(zhuǎn)化率為35%，γ-CD轉(zhuǎn)化率為8.4%。隨著加酶量的增加3種環(huán)糊精的比例有所改變，α-CD的含量逐漸增加，β-CD、γ-CD的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。隨著加酶量的增加，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率并沒有增加，可能的原因是CGT酶是一種多功能酶，可以催化4種反應(yīng)，其中歧化反應(yīng)和耦合反應(yīng)可以降解淀粉產(chǎn)生小分子糖，隨著加酶量的增加，這2種反應(yīng)強度增強，小分子糖增多，而小分子糖的存在會使得該酶的耦合反應(yīng)加劇，使環(huán)糊精解環(huán)，從而降低環(huán)糊精的產(chǎn)量[16]。

表1 加酶量對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of enzyme addition on cyclodextrin yield

注：括號內(nèi)百分數(shù)代表每種產(chǎn)物所占百分比

2.2.4 反應(yīng)時間對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

由圖6可知，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，隨著反應(yīng)時間的延長，γ-CD的比例逐漸下降，α-CD的比例逐漸提高；當反應(yīng)8 h時產(chǎn)量基本穩(wěn)定，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率最高為45.63%，其中β-CD的轉(zhuǎn)化率為35%，γ-CD的轉(zhuǎn)化率為8.4%。同種屬的菌株中，已發(fā)現(xiàn)的分泌CGT酶的菌株不多，其中包括Paenibacillusillinoisensis[17]、Paenibacillussp. xw-6-66[18]、Paenibacilluscampinasensissp.nov[19]以及Paenibacillusmacerans[20]等，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率在30%～40%。有研究表明，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)會向著產(chǎn)生小分子環(huán)糊精的方向移動，即α-CD的比例逐漸增加，γ-CD的比例逐漸下降[21]。該酶生產(chǎn)環(huán)糊精的最佳反應(yīng)時間為8 h，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率可達到45.63%，較少的反應(yīng)時間以及較高的環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率有利于降低生產(chǎn)成本，提高反應(yīng)效率。

圖6 反應(yīng)時間對環(huán)糊精產(chǎn)量的影響
Fig.6 Effect of reaction time on cyclodextrin yield

3 結(jié)論

環(huán)糊精是一種重要的環(huán)狀低聚糖，隨著其在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對其需求也日益增加。本文對來源于PaenibacilluscampinasensisSK13. 001的β-CGTase基因克隆到表達載體pET-22b(+)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)，經(jīng)過34 h的搖瓶培養(yǎng)，其環(huán)化活力達到15 U/mL，這為進一步實現(xiàn)β-CGTase的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

通過對重組β-CGTase的酶反應(yīng)工藝條件的優(yōu)化，研究其對3種環(huán)糊精的產(chǎn)量、比例以及轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，以100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)配制的質(zhì)量濃度為30 g/L玉米淀粉，55 ℃，加酶量為5 U/g干淀粉，反應(yīng)8 h；優(yōu)化反應(yīng)條件后環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率達到45.63%，其中α-CD的轉(zhuǎn)化率為2.23%，β-CD的轉(zhuǎn)化率為35%，γ-CD的轉(zhuǎn)化率為8.4%；這為環(huán)糊精的工業(yè)應(yīng)用提供參考。