曹小賀，張海波，包文智，劉麗娟*，夏海鋒*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 3(生物基材料重點實驗室(中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所)，山東 青島，266101) 4(內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010022)

異戊二烯是一種具有揮發(fā)性和疏水性的萜類烴分子[1]。異戊二烯在橡膠生產(chǎn)、香水和農(nóng)藥制造等領(lǐng)域有著廣泛的工業(yè)應(yīng)用[2]。目前異戊二烯的生產(chǎn)方法主要有C5餾分分離法、脫氫法和化學(xué)合成法[3-5]。工業(yè)合成異戊二烯主要是來自石油裂解C5組分[6]。但隨著石油資源的日益枯竭及其使用所帶來的污染使得異戊二烯的合成受到限制。近年來隨著合成生物學(xué)及代謝工程的發(fā)展，生物法合成異戊二烯作為一種綠色可持續(xù)的異戊二烯生產(chǎn)方法已經(jīng)成為研究熱點。

目前生物法合成類異戊二烯化合物的宿主菌主要是釀酒酵母和大腸桿菌。其中釀酒酵母作為真核類模式菌株，不僅具有遺傳背景清晰和高糖代謝分解速率等優(yōu)點[7]，而且它具有天然的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑，是生產(chǎn)異戊二烯類產(chǎn)品的良好宿主。乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)作為甲羥戊酸途徑的第一個前體物質(zhì)，是合成異戊二烯類化合物所必需的。在釀酒酵母中Acetyl-CoA 分布在細胞質(zhì)、線粒體、過氧化酶體及細胞核4個不同的亞細胞區(qū)域[8]。在線粒體中，Acetyl-CoA 是由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase，PDH)催化丙酮酸生成的。線粒體具有Acetyl-CoA含量豐富，能阻止中間產(chǎn)物進入競爭途徑等優(yōu)點。有不少學(xué)者通過充分利用線粒體Acetyl-CoA來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。LV等[1]通過在釀酒酵母線粒體中引入MVA途徑，顯著提高了異戊二烯的產(chǎn)量。AVALOS等[9]在釀酒酵母中將Ehrlich途徑引入到線粒體中，使異丁醇產(chǎn)量得到了提高。雖然在線粒體中合成目標(biāo)產(chǎn)物有一定益處，但往往需要將代謝途徑引入線粒體中，操作復(fù)雜，同時存在過多中間體的積累會抑制細胞生長的問題[10]。而在酵母細胞質(zhì)中合成目標(biāo)產(chǎn)物對細胞的生長沒有影響。在酵母細胞質(zhì)中，Acetyl-CoA是由乙酰輔酶A合成酶(Acetyl-CoA synthetase，ACS)合成的[7]。LV等[11]通過過表達基因ADH2、ALD6、ACS1和ACS2，顯著提高了釀酒酵母中異戊二烯的產(chǎn)量；SHIBA等[12]通過在釀酒酵母中過表達乙醛脫氫酶和來自腸道沙門氏菌的Acetyl-CoA合成酶，使得紫穗槐二烯產(chǎn)量增加了1.2倍。MEADOWS等[13]過表達木酮糖-5-磷酸特異性磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因(5-phosphate-speific-phosphoketolase)(LmPK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphotransacetylase)(CkPTA)基因，從5-磷酸-木酮糖經(jīng)LmPK和CkPTA催化合成Acetyl-CoA并將碳流重新定向，提高了釀酒酵母中法尼烯的產(chǎn)量。此外，CARDENAS等[14]通過敲除釀酒酵母中一系列與丙酮酸及Acetyl-CoA線粒體轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因增加細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量，提高了聚酮類化合物三乙酸內(nèi)酯的產(chǎn)量，其中MPC2、POR2、PDA1和YAT2基因具有最好的效果。

綜上，本研究以來源于銀白楊的ispS為基礎(chǔ)，通過敲除線粒體丙酮酸載體(MPC2)、線粒體孔蛋白 (POR2)和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的E1α亞基(PDA1)基因來切斷Acetyl-CoA往線粒體的支流，增加細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量。根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果，進而在細胞質(zhì)中引入來自Leuconostocmesenteroide和Clostridiumkluyveri的木酮糖5-磷酸特異性磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因LmPK和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因CkPTA合成Acetyl-CoA來進一步增加通量。然后在此基礎(chǔ)上結(jié)合大腸桿菌IDI1進行發(fā)酵驗證。本研究結(jié)合代謝工程，旨在探索提高釀酒酵母異戊二烯產(chǎn)量的代謝途徑，為釀酒酵母合成異戊二烯工業(yè)化奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

異戊二烯，Aladdin公司；YNB 培養(yǎng)基，索萊寶有限公司；Drop-out-His /URA(Do-His/URA)，Clotech公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶,寶生物工程(大連)有限公司；無縫克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

菌株與質(zhì)粒如表1和表2所示。

表1 本研究中所用的菌株Table 1 Strains that used in this study

表2 本研究中所用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids that used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，需要時加入抗生素(氨芐青霉素 100 μg/mL 卡那霉素 50 μg/mL)。篩選培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L[含(NH4)2SO4]，葡萄糖 2 g/L，115 ℃滅菌 20 min，DO-His/URA 0.065 g/L，氨基酸溶液過濾除菌，固體培養(yǎng)基均在液體培養(yǎng)基中添加 2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基同篩選培養(yǎng)基，但把葡萄糖換為半乳糖。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast peptone dextrose，YPD)液體培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，115 ℃ 滅菌 30 min，固體培養(yǎng)基均在液體培養(yǎng)基中添加 2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR 基因擴增儀，美國 Bio-Rad 公司；氣相色譜儀，美國安捷倫；紫外可見分光光度計，美國 Varian公司；ALLegra X-22 型臺式冷凍離心機，美國 Beckman 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad 公司；LDZM-80KCS 型蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；WD-9405B 型水平搖床，北京六一儀器廠。

1.1.5 搖瓶培養(yǎng)條件

種子液的制備：將重組菌從 DO-His 篩選平板上挑取單菌落至 5 mL 篩選液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 24 h 后，即為種子液。重組菌發(fā)酵實驗：將種子液4 000 r/min離心5 min, 用無菌ddH2O重懸2次，然后轉(zhuǎn)接到 50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，使初始 OD600為 0.1，在 30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 72 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因擴增與重組

將來自Populusalba的ispS序列[15]進行合成并將密碼子按照釀酒酵母偏好性進行優(yōu)化，以ispS-F，ispS-R擴增ispS基因序列，獲得基因長度為1 788 bp的ispS基因。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃后延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接載體pESC-His，小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，進行 DNA 測序。以大腸桿菌基因組為模板，用EcIDI1-F、EcIDI1-R擴增EcIDI1，獲得大小549 bpEcIDI1基因。PCR程序同上，但延伸時間為30 s。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化。以pUG6質(zhì)粒為模板，用MPC2-F和MPC2-R分別擴增含有MPC2的上游、下游50 bp序列的KanMX基因，同理分別用PDA1-F、PDA1-R和POR2-F、POR2-R擴增KanMX基因。PCR程序同上。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化(引物序列見表3)。

表3 實驗所用引物Table 3 Primer used in this study

注：下劃線部分為酶切位點

1.2.2 重組菌株構(gòu)建

釀酒酵母轉(zhuǎn)化均采用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化方法[16]。轉(zhuǎn)化后涂布于相對應(yīng)的氨基酸缺陷 YNB 平板和其相應(yīng)抗生素平板，挑選轉(zhuǎn)化子，采用堿性水溶液破壁，具體操作為將挑取的單菌落置于 20 μL 30 mmol/L NaOH 溶液中，95 ℃、5 min，立即置于4 ℃、1 min，循環(huán)3～5次。

1.2.3 氣相色譜檢測

色譜條件[17]為Agilent 7890B. DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件為初始溫度50 ℃，保持30 s，以8 ℃/min升溫至100 ℃，立即以30 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min；進樣口溫度為150 ℃，載氣(氮氣)流速為1 mL/min；不分流模式。采用外標(biāo)法測定異戊二烯樣品的濃度，計算結(jié)果取 3 個平行發(fā)酵實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆和表達載體構(gòu)建

目前研究表明銀白楊的異戊二烯合酶具有較好的酶活性[18]，我們將銀白楊的ispS[15]經(jīng)華大基因合成并優(yōu)化，并以優(yōu)化后的ispS為模板，采用 PCR 法擴增ispS基因，擴增出特異性條帶，大小為1 788 bp。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和SalI 酶切并純化后，與經(jīng)相同酶切的載體 pESC-His 連接。在含有氨芐抗生素的 LB 平板上篩選陽性克隆，并通過菌落 PCR 鑒定陽性克隆(圖略)。抽提重組克隆菌株質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和SalI酶切得到1 788 bp和6 684 bp兩個片段(圖1-a)，說明ispS基因與載體pESC-His相連，經(jīng)測序驗證正確，載體pESC-His-ispS構(gòu)建成功。以大腸桿菌基因組為模板，用EcIDI1-F、EcIDI1-R擴增EcIDI1大小為549 bp (圖略)。將 PCR 產(chǎn)物純化后，與經(jīng)SpeI 和SalI 酶切的載體 pESC-His-ispS采用無縫克隆的方式連接。鑒定陽性克隆步驟同上(圖略)。抽提重組克隆菌株質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I 和SacI酶切，得到1 576 bp和7 728 bp的片段(圖1-b)，大小符合預(yù)期，經(jīng)測序驗證正確。驗證EcIDI1基因與載體pESC-His-ispS相連，載體pESC-His-ispS-EcIDI1構(gòu)建成功。

M-DL10000 DNA marker； 1-pESC-His-ispS質(zhì)粒雙酶切； 2-pESC-His-ispS-EcIDI1質(zhì)粒雙酶切 a-BamH I 和SalI 雙酶切產(chǎn)物；b-BamH I 和SacI 雙酶切產(chǎn)物
圖1 質(zhì)粒酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖
Fig.1 The agarose gel electrophoresis of plasmids enzyme digestion

2.2 PDA1， MPC2， POR2基因的敲除

以KanMX作為篩選標(biāo)記進行敲除基因是個傳統(tǒng)方法，其無需敲除或突變酵母內(nèi)源基因，不損傷菌株遺傳背景，是可替代營養(yǎng)缺陷型的理想遺傳標(biāo)記[19-20]，通常選擇以目的基因上下游500 bp作為同源片段，而本研究中，我們選擇上下游50 bp的同源片段進行敲除。如圖2所示，以pUG6質(zhì)粒[21]為模板，用MPC2-F和MPC2-R擴增KanMX基因，約1 700 bp。同理，用PDA1-F、PDA1-R和POR2-F、POR2-R擴增，獲得相應(yīng)的KanMX片段。然后用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將PCR擴增出來的3個片段分別轉(zhuǎn)入CEN.PK2-1C中，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。然后挑取轉(zhuǎn)化子，釀酒酵母 CEN.PK2-1C 基因組作為對照，以MPC2-TEST-F、MPC2-TEST-R進行菌落PCR驗證，對照組擴增出目的片段，大小為232 bp，而敲除菌株未擴增出目的條帶，說明MPC2基因敲除成功。同理，用PDA1-TEST-F、PDA1-TEST-R和POR2-TEST-F、POR2-TEST-R進行驗證，對照組擴增出大小分別為470 bp和 328 bp的條帶，而敲除菌株未擴增出目的條帶，說明敲除PDA1、POR2基因成功。這也證明了我們敲除設(shè)計的正確性，選取50 bp的同源片段也能準(zhǔn)確敲除目的基因，且設(shè)計更為便捷。

M-DL2000 DNA marker； CK-對照
圖2MPC2、PDA1和POR2基因的敲除驗證 瓊脂糖凝膠電泳圖
Fig.2 The agarose gel electrophoresis of knockout verification ofMPC2,PDA1andPOR2genes

2.3 GAL80的敲除及LmPK和CkPTA的過表達

CRISP-Cas9是一種近年來興起的基因編輯技術(shù)，具有使用方便、構(gòu)建簡單、可以覆蓋大多數(shù)區(qū)域的基因編輯需求和成本低等優(yōu)點[22]，因此我們選用該方法進行GAL80的敲除工作，該方法以 URA 為篩選標(biāo)記，可以在敲除基因的基礎(chǔ)上過表達其他基因，已經(jīng)成為酵母中常用的基因敲除并過表達基因的方法[23-24]。將實驗室保存的pUC19-ALD6US-TADH1-CkPTA-PGAL1-PGAL10-LmPK-TCYC1-ALD6DS 和 pUC19-GAL80US-TADH1-PGAL1-PGAL10-AaFS-TADH1-GAL80DS 質(zhì)粒分別以SacI，SacⅡ 進行酶切，對酶切產(chǎn)物 TADH1-CkPTA-PGAL1-PGAL10-LmPK-TCYC1和 pUC19-GAL80US-GAL80DS 膠回收純化。然后用 T4DNA Ligase連接，獲得載體pUC19-GAL80US-TADH1-CkPTA-PGAL1-PGAL10-LmPK-TCYC1-GAL80DS，然后用引物 LC-GAL80-F、LC-GAL80-R 擴增出片段GAL80US-TADH1-CkPTA-PGAL1-PGAL10-LmPK-TCYC1-GAL80DS，采用 CRISPR-Cas9方法[25]敲除GAL80基因，分別將 2 μL pML104 (SwaI、BclI 酶切)，10 μLGAL80-gRNA，18 μLGAL80US-TADH1-CkPTA- PGAL1-PGAL10-LmPK-TCYC1-GAL80DS 片段一起轉(zhuǎn)入△PDA1酵母感受態(tài)細胞中，涂 DO-URA平板，30 ℃培養(yǎng) 2～4 d。挑取轉(zhuǎn)化子，以 TEST-GAL80-F、TEST-GAL80-R 進行 PCR 驗證基因GAL80，對照組擴增出目的片段，大小為 458 bp，而敲除菌株未擴增出目的條帶，表明基因GAL80被成功敲除，然后分別以 TEST1-F、TEST1-R 和 TEST2-F、TEST2-R 進行 PCR，驗證片段GAL80US-TADH1-CkPTA-PGAL1,10-LmPK-TCYC1-GAL80DS是否被整合到基因GAL80處，驗證原理如圖3所示。電泳圖結(jié)果表明，敲除菌株分別擴增出大小為1 321 bp和1 500 bp的條帶，而對照組未擴增出目標(biāo)條帶(圖4)，說明敲除GAL80基因并過表達LmPK和CkPTA基因成功。

圖3GAL80 基因的敲除驗證原理圖
Fig.3 Schematic diagram ofGAL80 gene knockout verification

M-DL2000 DNA marker； CK-對照；1～3-菌株編號
圖4GAL80基因的敲除驗證瓊脂糖凝膠電泳圖
Fig.4 The agarose gel electrophoresis ofGAL80gene knockout verification

2.4 釀酒酵母工程菌株構(gòu)建及搖瓶發(fā)酵

本研究的目的是增加細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量，以生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物異戊二烯，所以我們選擇敲除有關(guān)丙酮酸和Acetyl-CoA往線粒體轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因，并在之前研究的基礎(chǔ)上[14]，選擇了MPC2，POR2，PDA1基因進行敲除。將表達載體 pESC-His-ispS分別轉(zhuǎn)入以上3個敲除體中，獲得工程菌 SC1、SC2 和 SC3。然后搖瓶發(fā)酵來檢測敲除MPC2，POR2，PDA1對異戊二烯產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖5所示，3種基因的敲除都使得異戊二烯的產(chǎn)量有了一定的提高，其中敲除PDA1的工程菌效果最好，產(chǎn)量達到35 μg/L。相比較原始菌株，產(chǎn)量提高了0.3倍。這與CARDENAS等[14]的實驗結(jié)果一致，通過敲除MPC2，POR2，PDA1會增加細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量。從而使目的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。但本研究中異戊二烯的產(chǎn)量沒有較大提高，可能是由于細胞質(zhì)中的Acetyl-CoA量還是較少，因此為了進一步增加酵母細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量，我們在△PDA2基礎(chǔ)上過表達基因LmPK和CkPTA[26]，獲得敲除體SC4，將表達質(zhì)粒 pESC-His-ispS轉(zhuǎn)入SC4，獲得工程菌pHB1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，過表達基因LmPK和CkPTA，異戊二烯的產(chǎn)量沒有得到進一步的提高(圖5)。因此我們推測可能是下游代謝通量較低，使得Acetyl-CoA的利用率下降。故根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取pHB1作為下一步實驗的基礎(chǔ)。

圖5 敲除Acetyl-CoA支流的有關(guān)基因和引入外源基因 對異戊二烯產(chǎn)量的影響
Fig.5 Effects of knockout of genes related to acetyl-CoA tributaries and introduction of foreign genes on isoprene production

2.5 下游通量的驗證

IDI1基因是異戊二烯合成途徑中的下游基因，它編碼類異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶，該酶參與可逆的異構(gòu)化反應(yīng)實現(xiàn) IPP 與 DMAPP 的相互轉(zhuǎn)化，是控制異戊二烯合成的關(guān)鍵步驟，調(diào)控該酶的表達對異戊二烯合成具有重要作用[27]。根據(jù)上述發(fā)酵實驗篩選得到工程菌pHB1，我們又在pHB1菌株中過表達大腸桿菌的IDI1基因。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，在上述實驗的基礎(chǔ)上進一步過表達IDI1基因，使得異戊二烯的產(chǎn)量達到54 μg/L，比原始菌株提高了約1倍。實驗結(jié)果和我們的推測一致，異戊二烯產(chǎn)量沒有提高的原因是下游代謝通量不暢。通過對發(fā)酵液OD600進行測定，發(fā)現(xiàn)過表達基因LmPK、CkPTA和IDI1對菌體的生長有一定的提高，可能是代謝流調(diào)節(jié)對菌體生長有一定的促進作用。綜上，通過基因敲除和過表達基因來單純的提高細胞質(zhì)中Acetyl-CoA的通量，由于代謝流的原因，并不能大幅提高異戊二烯的產(chǎn)量，因此還需要結(jié)合下游途徑關(guān)鍵酶的表達來共同起作用。

圖6 下游通量的驗證
Fig.6 Verification of the downstream flux

3 結(jié)論

異戊二烯是重要的平臺化合物，因此對異戊二烯生產(chǎn)方法的探索將會不斷持續(xù)下去。目前利用微生物法合成異戊二烯已有諸多報道[18, 28-29]，釀酒酵母作為食品安全級微生物，具有其獨特的優(yōu)勢。本文以釀酒酵母CEN.PK2-1C為宿主菌株，引入來源于Populusalba的異戊二烯合成酶，然后敲除了Acetyl-CoA通往線粒體支流的基因MPC2、PDA1和POR2，使得釀酒酵母中異戊二烯的產(chǎn)量得到了一定程度的提高。然后我們又過表達了來自Leuconostocmesenteroide和Clostridiumkluyveri的木酮糖-5-磷酸特異性磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因(LmPK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(CkPTA)來進一步增加細胞質(zhì)Acetyl-CoA的通量[26]，結(jié)果表明異戊二烯的產(chǎn)量并沒有進一步提高，我們推測是由于下游的代謝通路不暢造成的，因此我們通過過表達來源于大腸桿菌的關(guān)鍵酶(IDI1)進行驗證，發(fā)酵結(jié)果顯示，異戊二烯的產(chǎn)量達到了54 μg/L，比原始菌株提高了約1倍，和我們推測的基本吻合。本研究旨在探索釀酒酵母中提高異戊二烯產(chǎn)量的基因策略，并取得了一些成效，雖然在產(chǎn)量上和LV 等[11]還有較大差距，但研究為后續(xù)異戊二烯的研究工作提供了一些見解和參考，同時本研究也為異戊二烯的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。