韓金宏 葛晨晨 李太元

摘 要：本文對延吉地區(qū)某雞場送來的10例肉雞大腸桿菌疑似感染病例進(jìn)行病原分離與鑒定、菌株致病性試驗和藥物敏感性試驗等。就實驗結(jié)果進(jìn)行分析，有8株疑似菌株，呈短桿狀，革蘭氏染色陰性菌，形態(tài)特征及生化鑒定符合大腸桿菌特性，確定為大腸桿菌菌株，具有較強(qiáng)的致病性，對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類藥物均有較強(qiáng)的耐藥性，但對喹諾酮類藥物的敏感性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;鑒定;肉雞;藥敏試驗

大腸桿菌病是由致病性大腸埃希桿菌引起的一種較為常見的傳染性疾病，可造成人和畜禽的腹瀉、出血性胃腸炎，嚴(yán)重的可造成死亡，易對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p害。

目前，臨床上防控大腸桿菌傳染常使用抗生素，而抗生素的濫用不僅會使耐藥菌大量產(chǎn)生，還會使得抗生素及耐藥菌株跟隨食物鏈進(jìn)入人體，對人體健康造成一定程度的威脅。同時，全世界各地區(qū)流行的大腸桿菌菌株對于抗生素的耐藥性均有不同程度的差異，也給大腸桿菌的防控帶來了困難。本文通過一系列試驗并對結(jié)果進(jìn)行分析，以期為大腸桿菌病的防控防治工作提供參考依據(jù)。

1.材料與方法

1.1肉雞病例

延吉某雞場送來5只疑似大腸桿菌感染致死的肉用雞及5只未死的同籠雞待檢。雞群出現(xiàn)流行病學(xué)癥狀后曾使用該養(yǎng)殖場常用的頭孢類藥物，但未能有效控制疾病傳播。

1.2主要藥品和試劑

實驗所用LB肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基及瓊脂粉均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，革蘭氏染液購自河南柯炫生物技術(shù)有限公司，生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3主要儀器

壓力蒸汽滅菌器（MSL.N型），生物顯微鏡（BX53型），凈化工作臺（SW-CJ-2FD型），電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH-B11？600-S型）。

1.4臨床觀察及采集樣品

病死雞剖檢可見：小腸、泄殖腔等粘膜彌漫性出血，有不同程度的出血點、出血斑;膽腫大;心外膜有黃白色膠凍樣纖維性滲出物附著;心包液增多、肝臟腫大、質(zhì)脆、呈暗紅色或土黃色;就肝臟部分進(jìn)行無菌采樣，進(jìn)行實驗室診斷。對同籠活雞進(jìn)行臨床診斷，發(fā)現(xiàn)同籠活雞出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退的現(xiàn)象，且個別伴有腹瀉的癥狀，將活雞處死后對肝臟部分進(jìn)行采樣并帶回實驗室。

1.5細(xì)菌分離及純化

無菌操作采集病料，在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，置恒溫培養(yǎng)箱37℃下24h培養(yǎng)，選取紅色獨(dú)立菌落在麥康凱培養(yǎng)基上連續(xù)傳代3次后，在伊紅美蘭培養(yǎng)基上接種，選取紫黑色且?guī)в薪饘俟鉂傻木溥M(jìn)行純化，并對該菌種進(jìn)行保存。

1.6分離細(xì)菌的鑒定

1.6.1細(xì)菌形態(tài)及染色特性觀察

對分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察形態(tài)及染色特征。

1.6.2細(xì)菌生化實驗檢測

對分離純化的疑似菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗、V-P試驗、MR試驗、運(yùn)動力試驗并觀察記錄，選取符合大腸桿菌生化特性的菌株進(jìn)行致病性試驗。

1.7細(xì)菌致病性實驗

將生化鑒定后的大腸桿菌接種于LB肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，稀釋菌液至3×10？cfu/mL，備用;選用C57小鼠作為實驗動物，3只/組，設(shè)立對照組，腹腔注射稀釋菌液0.3ml/只，進(jìn)行為期48h的觀察，記錄采食量、飲水量、精神狀態(tài)、排糞情況及其它病狀。及時進(jìn)行剖檢及肝臟血涂片，顯微鏡下觀察細(xì)菌。

1.8細(xì)菌藥敏試驗

選用慶大霉素（GEN）、青霉素（P）、四環(huán)素（TET）、頭孢噻肟（CTX）、氧氟沙星（OFL）、氯霉素（C）等抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗。

將分離出的大腸桿菌接種于普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h，選取多個菌落用無菌生理鹽水配制成菌懸液，調(diào)整含菌量為1.5×10？cfu/mL，吸取350微升于4mm厚基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，均勻涂抹后將預(yù)先準(zhǔn)備好的藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，24h后觀察結(jié)果進(jìn)行記錄分析。

2.結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)觀察結(jié)果

細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色，鏡下觀察呈革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，大小為0.3-0.6×1.1-1.7μm，單獨(dú)或成組分布，無芽孢（參見圖1）。

2.2生化試驗結(jié)果

分離細(xì)菌生化實驗結(jié)果如表1所示[1]。

2.3致病性試驗結(jié)果

攻毒6h后，小鼠普遍出現(xiàn)食欲不良，精神萎靡的癥狀，眼角出現(xiàn)白色顆粒狀物質(zhì);12h開始，出現(xiàn)死亡病例，肛門處有糞便漬粘于毛發(fā)上;36h后，不再出現(xiàn)死亡病例，食欲及飲水量逐漸恢復(fù)正常;48h后處死所有小鼠，進(jìn)行剖檢及血涂片檢測，對照組始終未出現(xiàn)任何癥狀。

對病死的實驗鼠進(jìn)行剖檢，普遍可見腹部膨大，有腹水，呈淡黃色膠凍樣液體，味惡臭，腸道有不同程度的出血點、出血灶;胃部腫大，積有膿性分泌物，個別可見壞死灶;肝部腫大，質(zhì)脆，個別可見出血點、灰白色壞死灶或結(jié)節(jié)。處死的實驗鼠亦可見上述病況，但相對較輕。

肝臟血涂片鏡檢可以觀察到兩端鈍圓的G-短桿狀菌數(shù)量不等的散在排列在抹片上（參見圖2）。

根據(jù)致病性試驗結(jié)果分析可知，細(xì)菌形態(tài)且剖檢結(jié)果符合大腸桿菌致病病理變化。

2.4藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥物敏感性實驗結(jié)果（見表2）參照多重耐藥（MDR）、泛耐藥（XDR）、全耐藥（PDR）多重耐藥菌暫行標(biāo)準(zhǔn)，計算菌株對各類藥物的耐藥率及敏感率（見表3）。

對藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行分析，大腸桿菌對青霉素、頭孢克肟、四環(huán)素、氯霉素藥物具有較強(qiáng)的耐藥性，而對氧氟沙星最為敏感，慶大霉素次之。

3.結(jié)論

根據(jù)上述實驗結(jié)果分析，該養(yǎng)殖場送檢的肉雞病例可以確定為大腸桿菌感染，所感染的大腸桿菌致毒力較強(qiáng)，易對該雞場的禽類造成嚴(yán)重?fù)p害，對生產(chǎn)養(yǎng)殖亦造成嚴(yán)重阻礙。且養(yǎng)殖場頻繁使用抗生素使得大腸桿菌耐藥性增強(qiáng)，對藥物的敏感率普遍較低。

4.建議

（1）輪換使用各類抗生素，避免同一類抗生素在一段時間內(nèi)頻繁使用，少用或不使用耐藥性高的抗生素，慎用敏感性高的藥物。

（2）適當(dāng)增加維生素和微生態(tài)制劑，以加強(qiáng)動物機(jī)體抵抗力;定時添加乳酸菌片，保證動物機(jī)體的腸道菌群平衡。

（3）做好飼養(yǎng)管理工作，保障飼養(yǎng)場所的干凈衛(wèi)生和通風(fēng)性，定期進(jìn)行消毒清理工作，保證飲食質(zhì)量，防止飲水和飼料受到污染。

（4）結(jié)合實際情況，選擇性地對畜禽進(jìn)行免疫接種。

（5）及時發(fā)現(xiàn)并隔離患病畜禽，對整個畜群進(jìn)行藥物防治，適當(dāng)采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]微生物實驗指導(dǎo)/李太元，許廣波主編.-北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016.8

[2]倪春霞， 蒲萬霞， 胡永浩，等. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥 性分析 [J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2010（2）： 20-24.

[3]龔中貴.雞大腸桿菌病病原分離鑒定及藥敏實驗[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2009，25（06）：344-346.

[4]王曉， 王新， 郝丹，等. 奶牛乳源大腸桿菌耐藥性， 毒素基因鑒定及 PFGE 分型研究 [J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 45（3）： 463-470.

[5]楊立軍，韓先干，尹會方，羅燕秋，左佳坤，徐達(dá)，呂小龍，吳小卡，周鍵，王少輝，李金貴，于圣青.福建省龍巖市禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力因子及耐藥研究[J].中國動物傳染病學(xué)報，2016，24（06）：24-29.

[6]陳楠楠，史同瑞，尹珺伊，侯美如，王巖，秦平偉，劉宇，朱戰(zhàn)波.齊齊哈爾地區(qū)仔豬腹瀉大腸桿菌血清型與毒力基因分析[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2018，30（06）：19-23.

[7]Itzia Azucena Rangel-Casta？eda，José Roberto Cruz-Lozano，Martin Zerme？o-Ruiz，Rafael Cortes-Zarate，Leonardo Hernández-Hernández，Gabriela Tapia-Pastrana，Araceli Castillo-Romero. Drug Susceptibility Testing and Synergistic Antibacterial Activity of Curcumin with Antibiotics against Enterotoxigenic Escherichia coli .[J]. Antibiotics （Basel， Switzerland），2019，8（2）.

作者簡介：

一作：韓金宏（1998-），男，漢族，本科在讀，延邊大學(xué)，研究方向：動物醫(yī)學(xué)

二作：葛晨晨（1998-），男，漢族，碩士在讀，延邊大學(xué)，研究方向：微生物學(xué)

通訊作者：李太元（1962-），男，朝鮮族，碩士學(xué)位，教授，延邊大學(xué)，研究方向：微生物學(xué)與免疫學(xué) .