摘 要：CAR-T療法就是嵌合抗原受體T細胞免疫療法。這是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法，近幾年通過優(yōu)化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，本文介紹了其生產(chǎn)的工藝流程及車間設計的要點。

關鍵詞：細胞治療產(chǎn)品;車間設計

近年來，免疫治療經(jīng)歷了一系列突飛猛進的發(fā)展，以特異性過繼免疫細胞療法及免疫檢查點抗體療法為代表的新型免疫治療技術因其在臨床研究中取得的顯著療效而成為學術界和產(chǎn)業(yè)界共同關注的焦點。隨著我國對CAR-T技術的研究不斷深入，國內企業(yè)的積極布局和產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，我國的CAR-T細胞治療技術也在緊隨國際趨勢的發(fā)展。為了適應我國CAR-T細胞治療產(chǎn)業(yè)的需要，加強CAR-T細胞治療的質量管理，國家出臺了相應的規(guī)范及技術指導原則，筆者結合項目實際案例，針對此類廠房的設計要點進行研究。

1 CAR-T（細胞治療）產(chǎn)品的特點

CAR-T生產(chǎn)工藝復雜、要求高。CAR-T療法不同于傳統(tǒng)藥物，是一種基于整合了CAR基因的自體T細胞療法。這意味著CAR-T必須在盡可能短的時間內完成抽血、分離、激活、轉染、擴增、制劑、放行、凍干、運輸和給藥。其生產(chǎn)的特點是：（1）產(chǎn)品個性化很強，需要模塊化生產(chǎn);（2）單個產(chǎn)品規(guī)模小，但是操作復雜;（3）生產(chǎn)全過程需要無菌控制，同時防止不同產(chǎn)品之間的交叉污染。

2 總體設計思路

結合CAR-T（細胞治療）產(chǎn)品的特點，在進行工廠設計時一般包括生產(chǎn)單元、儲存單元、質控檢測單元等，CMO公司還會有技術轉移單元。其中核心的生產(chǎn)單元包括產(chǎn)品的制備區(qū)和病毒、質粒載體區(qū)，但是隨著工藝的更新，非載體的細胞治療產(chǎn)品越來越多，安全性越來越高，很多廠家只保留了核心的細胞產(chǎn)品制備區(qū)。細胞治療產(chǎn)品、病毒載體和質粒的生產(chǎn)應當分別在各自獨立的生產(chǎn)區(qū)域進行，并配備獨立的空調凈化系統(tǒng)。

3 CAR-T細胞終產(chǎn)品制備工藝流程

（1）采集接收外周血。

（2）操作前準備：從試劑間冰箱中取出細胞培養(yǎng)基，恢復室溫。生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉入安全柜內。

（3）分離單個核細胞（PBMC）：使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內外周血轉入離心管中。用緩沖液按比例稀釋外周血，混勻。

（4）將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的人淋巴細胞分離液的離心管中離心。離心完成后，離心管出現(xiàn)明顯分層由下至上：紅細胞層，粒細胞層，F(xiàn)icoll層，單個核細胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層左右處棄之。小心吸取紅細胞層以上的所有液體至離心管中，稀釋，混勻。

（5）離心，重懸細胞混勻，取少量細胞計數(shù)。離心，上清液送檢無菌檢測。

（6）細胞培養(yǎng)：在一定溫濕度及CO2濃度條件下，進行細胞培養(yǎng)。定期觀察細胞生長情況，主要觀察其形態(tài)的變化，數(shù)目及增值情況，細胞碎片及雜質情況，每2-3天加液培養(yǎng)。根據(jù)細胞狀態(tài)和臨床治療需要，培養(yǎng)至細胞數(shù)量達到要求，各項檢測合格。包括：無菌檢測，內毒素檢測，細胞活力，細胞表型等。

（7）5Car-T細胞收集：確認細胞各項檢測己符合要求。根據(jù)治療方案（一般一個療程分多次回輸，間隔時間為1天），取出相應細胞懸液，剩余細胞補加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，供再次回輸。細胞懸液轉入離心管中，離心。除去上清培養(yǎng)液，加緩沖液稀釋混勻，離心，棄上清。

（8）細胞裝袋（一般靜脈回輸，采用100ml雙閥鹽水袋），離心完成后取上清，做無菌檢測，生理鹽水重懸細胞，100μm細胞濾網(wǎng)過濾，取少量細胞懸液進行細胞數(shù)量，細胞活率，革蘭氏檢測，內毒素檢測。細胞過濾完成，轉入100ml鹽水袋中，加5%注射用人血白蛋白，貼上標簽，并填寫相關記錄。

（9）細胞運輸與保存：核對細胞標簽內容，填寫回輸發(fā)放記錄。細胞鹽水袋放置于運輸容器內（一般為疫苗箱，4度），填寫交接記錄表。

4 車間工藝平面設計

總體分為輔助區(qū)生產(chǎn)區(qū)、動力區(qū)、核心生產(chǎn)區(qū)、質檢區(qū)（如下圖）：

核心生產(chǎn)區(qū)包括樣本登記預處理區(qū)、細胞制備區(qū)、試劑配制區(qū)、成品凍存區(qū)、廢棄物處理區(qū)。

輔助生產(chǎn)區(qū)主要為核心生產(chǎn)區(qū)B級區(qū)提供輔助功能，包括B級區(qū)人員更衣通道，一次物料的傳遞，環(huán)境清潔與消毒所需的試劑配制，B級區(qū)潔凈服的清洗與滅菌等。輔助生產(chǎn)區(qū)的潔凈級別設置為C級。

動力區(qū)主要包含空調系統(tǒng)，氣瓶間，純化水系統(tǒng)，配電系統(tǒng)。

質檢區(qū)主要是CAR-T的放行檢測，包括生化檢測、微生物檢測、細胞學檢測。生化檢測實驗室主要使用了PCR儀等設備，用于CAR-T的鑒別和純度檢測。

5 人物流設計

人員通過車間西北側樓梯進入二層，在二層設置人員更鞋、總更衣，人員經(jīng)總更后，進入細胞與基因治療研究中心，一般生產(chǎn)區(qū)人員直接進入一般生產(chǎn)區(qū)各生產(chǎn)崗位;潔凈區(qū)人員需再經(jīng)過換鞋脫外衣、洗手、穿潔凈衣、手消毒等方可進入生產(chǎn)區(qū)，疏散設置相應的安全門。

物流途徑：原輔料和包材通過一層車間東北部的電梯運輸?shù)蕉蛹毎c基因治療研究中心，通過緩沖間進入凈化車間，成品再通過車間東北部的電梯運輸出去。

6 空調系統(tǒng)設計

空調系統(tǒng)一共分為三個系統(tǒng)：普通生產(chǎn)區(qū)（CNC）、輔助生產(chǎn)區(qū)（C級）、核心生產(chǎn)區(qū)（B級）。潔凈區(qū)一般設計溫度18℃～26℃，相對濕度45%～65%。相鄰的不同潔凈級別的房間的壓差應保持在15Pa（門關的狀態(tài)）。有潔凈級別的房間與室外的壓差應大于等于15Pa。相同潔凈等級的房間將在相對潔凈的房間到其它房間維持5Pa的正壓，以保證污染從相對潔凈的房間到相對非潔凈的房間。空氣處理方式：新風與回風經(jīng)空調箱初效，中效過濾后，經(jīng)高效送風口送入室內。B級區(qū)采取CAV、VAV方式穩(wěn)定控制壓差。氣流組織為：潔凈區(qū)為上送下側回，CNC區(qū)為上送上回。

7 公用工程系統(tǒng)設計

公用工程系統(tǒng)主要包含潔凈公用工程系統(tǒng)和非公用工程系統(tǒng)。CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)主要采用一次性技術，所以潔凈公用工程系統(tǒng)相對簡單，包含純化水系統(tǒng)、純蒸汽系統(tǒng)、CO2系統(tǒng)。

（1）純化水系統(tǒng)主要用于潔凈服的清洗、輔助生產(chǎn)區(qū)的器具、潔具的清洗、操作人員洗手。

（2）純蒸汽系統(tǒng)主要用于核心生產(chǎn)區(qū)（B級）的工作服的滅菌。

（3）CO2系統(tǒng)主要用于細胞培養(yǎng)使用，使用外部采購氣瓶，放置在潔凈區(qū)外面的氣瓶間，通過管路輸送至工位上使用。

非潔凈公用工程系統(tǒng)主要包含空調冷水系統(tǒng)，蒸汽系統(tǒng)，壓縮空氣系統(tǒng)，配電系統(tǒng)。

（1）空調冷水系統(tǒng)，蒸汽系統(tǒng)主要為潔凈空調系統(tǒng)提供冷熱源，控制潔凈區(qū)的溫度和濕度。

（2）壓縮空氣系統(tǒng)主要用于部分氣動閥門的動力。

8 設計重點分析

（1）如果細胞分離，培養(yǎng)擴增，分裝等操作在一個房間進行，則同時只能生產(chǎn)一個批次的產(chǎn)品，所有的操作應當在生物安全柜中進行;如果采用隔離器操作以及全自動密閉設備生產(chǎn)，環(huán)境等級可以適當降低到C級。

（2）當核心生產(chǎn)區(qū)設置為B級時，由于CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)主要采用一次性技術，所以大部分耗材，試劑通過輔助生產(chǎn)區(qū)，采用VHP（過氧化氫）對內包材進行滅菌后傳入B級區(qū)，樣品包裝表面由于無法通過VHP以及高溫消殺，只能通過化學消毒劑進行消殺，其效果必須經(jīng)過驗證。

（3）核心生產(chǎn)區(qū)大多采用生物安全柜操作，由于房間面積不大，需要對壓差進行動態(tài)控制，防止不同工況下壓差波動巨大。常規(guī)通過變風量系統(tǒng)進行自動調節(jié)。

（4）核心操作區(qū)內的廢液，與細胞直接接觸的一次性耗材，都需要在核心區(qū)內滅活后方可拿出核心區(qū)。

9 結語

目前隨著CAR-T技術的運用及發(fā)展，CAR-T生產(chǎn)工藝也在一直不斷更新，生產(chǎn)工藝朝著高度自動化，模塊化方向發(fā)展。在具體工程設計時，要結合具體的工藝路線進行設計，在設計上杜絕不同病例產(chǎn)品之前的交叉污染，同時兼顧產(chǎn)品工藝變化的靈活性。

參考文獻：

[1]陳國筍.細胞治療產(chǎn)品的工藝平面與廠房設施的設計.上海醫(yī)藥，2019（9）.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部令第79號.藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范[4]（2010年修訂）[S].

作者簡介：陳方超（1985-），男，漢族，江蘇南京人，本科，工程師，目前從事制藥工程工藝設計。