張晗 魏來(lái) 廖旭 王佳妮 史秋月 張嫻

摘 要 自行研制了激光剝蝕取樣與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用接口，建立了以激光剝蝕微量取樣的微區(qū)有機(jī)碳同位素分析方法?？疾炝瞬都瘯r(shí)間、樣品量和激光能量等對(duì)同位素分餾的影響，采用3種標(biāo)樣驗(yàn)證了分析方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，此裝置可對(duì)固體樣品進(jìn)行高靈敏度的連續(xù)在線分析，樣品用量?jī)H10?8 g，比傳統(tǒng)的元素分析同位素質(zhì)譜聯(lián)用方法的樣品用量降低了104倍。本方法有效避免了激光剝蝕在取樣、傳輸和離子化過(guò)程的多種分餾因素，獲得了可重復(fù)的、高精度的測(cè)試結(jié)果。以13C標(biāo)記的水稻為例，在葉尖獲得了橫截面的碳同位素分布差異信息。結(jié)合激光剝蝕技術(shù)原位取樣的優(yōu)勢(shì)，此技術(shù)可用于考察固體樣品微區(qū)高分辨的碳同位素分布，在環(huán)境、農(nóng)林學(xué)、生態(tài)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 激光剝蝕;有機(jī)碳穩(wěn)定同位素;原位碳同位素分析

1 引 言

激光剝蝕（Laser ablation）顯微取樣技術(shù)是地球、環(huán)境和考古科學(xué)研究中重要的分析工具[1]。 該技術(shù)樣品用量少，制樣簡(jiǎn)單，可遠(yuǎn)程、實(shí)時(shí)、在線，相對(duì)快速地處理、提取樣品，并具備高空間分辨率能力，可將101～102 μm深度的測(cè)量剖面劃分成不同區(qū)域，以描述其生長(zhǎng)帶或擴(kuò)散梯度空間，具有相當(dāng)大的分析靈活性。激光剝蝕用于電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）分析的技術(shù)已經(jīng)很成熟，是高靈敏度、多元素微區(qū)微量原位快速分析技術(shù)。將激光燒蝕顯微取樣方式與氣體同位素質(zhì)譜聯(lián)用（Laser ablation-isotope ratio mass spectrometry，LA-IRMS）一方面可快速地將固體樣品直接引入同位素質(zhì)譜，避免離線制樣的種種困難，減免氣體交換風(fēng)險(xiǎn)，提高取樣的準(zhǔn)確度和進(jìn)樣效率;另一方面可充分利用激光燒蝕微區(qū)原位取樣優(yōu)勢(shì)，取樣量低，分析時(shí)間短，可獲得包含固體樣品空間信息的二維同位素分布圖像。

目前已有一些相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，如Moran等[2]采用LSX-500Nd：YAG激光，以266 nm波長(zhǎng)輸出，燒蝕固體樣品表面，設(shè)計(jì)了圓形不銹鋼剝蝕腔體，剝蝕后的樣品通過(guò)催化燃燒后，以六通閥門(mén)導(dǎo)入定量環(huán)，引入氣體穩(wěn)定同位素質(zhì)譜。該技術(shù)成功將原來(lái)至少25 μg碳樣品量降低至65 ng，后續(xù)成功應(yīng)用該技術(shù)示蹤了生物墊（Microbial mats）內(nèi)不同類(lèi)型藻類(lèi)微生物群落對(duì)標(biāo)記的碳酸鹽的累積狀況，實(shí)現(xiàn)了50 μm的空間分辨率[3]。2019年，該課題組又利用該技術(shù)研究了根系碳在土壤中的分配[4]。 van Roij等[5]于2017年設(shè)計(jì)的ng級(jí)激光燒蝕系統(tǒng)與同位素質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單花粉顆粒的激光取樣同位素檢測(cè)。該設(shè)備采用193 nm DUV（深紫外）ArF激光，設(shè)計(jì)了微量激光燒蝕腔體與氣相色譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)流多點(diǎn)位即時(shí)采樣。最近，該研究組采用該技術(shù)對(duì)單個(gè)水蚤進(jìn)行了多次采樣（常規(guī)分析通常需要大于20只水蚤），并獲得了良好的重現(xiàn)性[6]。2019年，Rodionov等[7]采用213 nm激光剝蝕與PreCon聯(lián)用，研究了根系分泌物對(duì)土壤微生物影響，發(fā)現(xiàn)25%～50% 的根系碳在300 μm區(qū)域內(nèi)與土壤/土壤微生物進(jìn)行交換。

然而，目前相關(guān)研究仍存在因同位素質(zhì)譜載氣流速限制，為了完全吹掃樣品而不得不限制樣品池體積，以致樣品池過(guò)小而應(yīng)用受限的問(wèn)題[5]，以及載氣不純或系統(tǒng)連接處微漏等因素累積導(dǎo)致空白背景信號(hào)過(guò)高[7]等缺陷。本研究對(duì)現(xiàn)有聯(lián)用設(shè)備的缺陷進(jìn)行了針對(duì)性改進(jìn)，研制了通用性強(qiáng)、低背景的樣品池，優(yōu)化了接口設(shè)計(jì)和測(cè)試條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)固體樣品原位、快速、微量、高精度有機(jī)碳同位素分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UP-213激光剝蝕系統(tǒng)（New Wave公司）;Delta V advantage穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀、PreCon氣體預(yù)濃縮系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

自行研制的激光剝蝕與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用接口包含： （1）復(fù)合吸附凈化裝置 由于激光剝蝕取樣在納克級(jí)別，干凈的背景尤為重要。系統(tǒng)背景主要來(lái)源于兩方面： 系統(tǒng)管路各接頭和樣品池的密閉性導(dǎo)致空氣中CO2和其它含碳雜質(zhì)進(jìn)入;載氣純凈度。由于采用冷阱富集，在富集樣品的同時(shí)，載氣中含碳雜質(zhì)亦同時(shí)被累積。本套系統(tǒng)對(duì)載氣采用分級(jí)凈化，針對(duì)烴類(lèi)雜質(zhì)，在氦氣管路增加烴類(lèi)捕集阱（In-line gas purifiers，Agilent）;針對(duì)CO采用舒茨試劑（I2O5）捕集;針對(duì)CO2采用NaOH捕集，另加裝Mg（ClO4）2除去痕微量剝蝕出的H2O，多重復(fù)合吸附劑共同作用，確保零背景信號(hào)。（2）樣品池和樣品臺(tái) 簡(jiǎn)化樣品池，除頂部石英玻片采用螺絲固定，其余為不銹鋼拋光加工，一體成型，避免漏氣。樣品池直徑30 mm，體積5.65 mL，遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)[3]樣品池尺寸，適用范圍更寬。商業(yè)化的激光剝蝕一般用于ICP-MS，流量高達(dá)1 L/min，而同位素質(zhì)譜載氣僅為1～2 mL/min。為了保證完整吹掃，樣品池內(nèi)壁為弧形設(shè)計(jì)，載氣流量25 mL/min，在雙冷阱處以六通閥切換至1 mL/min后進(jìn)入質(zhì)譜。（3）高溫反應(yīng)爐 由于剝蝕出的樣品為有機(jī)氣溶膠，需轉(zhuǎn)化為CO2進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜。采用熱電公司Precon內(nèi)微量高溫反應(yīng)爐，在1000℃高溫下，將剝蝕出的氣溶膠定量轉(zhuǎn)化為CO2。（4）雙冷阱富集裝置 由于樣品傳輸存在先后，為完整收集剝蝕樣品，對(duì)高溫爐轉(zhuǎn)化后的CO2采用冷阱捕集，并二次聚焦，確保完整反映樣品真實(shí)信息，并減少樣品間干擾。（5）反吹系統(tǒng) 為避免樣品殘存在樣品池或傳輸管路，加裝反吹載氣，在樣品采集后，開(kāi)啟反吹，自高溫爐往回吹掃，經(jīng)過(guò)反應(yīng)池和化學(xué)吸附阱后排空。（6）水阱 在進(jìn)入質(zhì)譜離子源前加裝半透膜水阱，以氦氣吹掃，除去高溫爐生成并從冷阱內(nèi)逸出的少量水分。整套裝置設(shè)計(jì)和實(shí)物如圖1所示。

標(biāo)準(zhǔn)樣品： IAEA-CH-7（聚乙烯塑料薄膜，國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)）;IAEA 600（粉末狀半胱氨酸，國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)）;Urea（粉末狀尿素，IVA Analysentechnik）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 檢出限和靈敏度計(jì)算方法 在激光剝蝕前加裝三通，其中兩通連接氣路，一通采用橡膠隔墊密封，用于直接注射CO2，以計(jì)算裝置的靈敏度，判斷激光剝蝕的樣品量和無(wú)激光剝蝕時(shí)整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。連續(xù)8次注射1 μL CO2標(biāo)準(zhǔn)氣，平均峰面積為83.25 Vs，根據(jù)氣體摩爾體積公式計(jì)算，1 μL CO2氣體中含有535.2 ng碳，即該套系統(tǒng)的靈敏度（碳）為6.4 ng/（V s）。 同時(shí)，Delta V advantage同位素質(zhì)譜獲得穩(wěn)定測(cè)試結(jié)果要求信號(hào)在500 mV以上，對(duì)應(yīng)體積約0.7 Vs，由此計(jì)算該套系統(tǒng)測(cè)試檢測(cè)下限為～4.5 ng碳。

2.2.2 激光剝蝕原位有機(jī)碳同位素分析方法 （1）測(cè)試開(kāi)始，將六通閥切換至Load模式，放下冷阱1至液氮。打開(kāi)激光剝蝕，選好能量、光斑、剝蝕方式等參數(shù)，預(yù)熱6 s后，開(kāi)始剝蝕。（2）剝蝕時(shí)間通常延續(xù)5～20 s，富集過(guò)程通常持續(xù)50～100 s，確保剝蝕出的氣溶膠樣品被捕集完全，然后切換六通閥。（3）放下冷阱2，預(yù)冷5 s，同時(shí)打開(kāi)反吹清掃樣品池。（4）提起冷阱1，將富集的樣品轉(zhuǎn)移至冷阱2。（4） 提起冷阱2，將樣品送入質(zhì)譜測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)空白

經(jīng)過(guò)多重凈化材料吸附，背景信號(hào)被有效控制，冷阱富集載氣50 s時(shí)，整體背景信號(hào)僅0.015 V s，遠(yuǎn)優(yōu)于文獻(xiàn)[6]（50 s富集后，背景近2.0 V s）。富集100 s時(shí)，背景也僅0.105 V s，完全滿足測(cè)試需求。

3.2 剝蝕樣品捕集條件測(cè)試

LA-ICPMS產(chǎn)生的分餾效應(yīng)發(fā)生在激光與樣品的相互作用過(guò)程、樣品氣溶膠顆粒的傳輸過(guò)程以及樣品氣溶膠在ICP等離子體中的離子化過(guò)程。將激光剝蝕應(yīng)用于同位素測(cè)試時(shí)，該問(wèn)題的解決同樣至關(guān)重要。激光剝蝕的氣溶膠顆粒能否代表樣品的原始組成，是否產(chǎn)生質(zhì)量歧視，能否傳輸完全，能否完全轉(zhuǎn)化為CO2并在離子源中定量檢測(cè)，是測(cè)試中需要考慮的因素。本研究對(duì)各過(guò)程影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

3.2.1 捕集時(shí)間 受同位素質(zhì)譜靈敏度限制，實(shí)際采樣根據(jù)樣品含碳量確定剝蝕長(zhǎng)度/面積，過(guò)程將持續(xù)數(shù)秒，

若實(shí)時(shí)采集，樣品峰將嚴(yán)重拖尾。本套聯(lián)用裝置采用雙冷阱富集，能夠?qū)γ看蝿兾g樣品中不同形態(tài)、不同大小和先后傳輸?shù)念w粒進(jìn)行完整收集，有效避免因前述過(guò)程導(dǎo)致的質(zhì)量歧視和同位素分餾，彌補(bǔ)了LA-ICPMS實(shí)時(shí)聯(lián)用過(guò)程中剝蝕氣溶膠和顆粒在傳輸和離子化過(guò)程帶來(lái)的分餾缺陷。

以國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)提供的IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜作為參考，確定冷阱捕集。在激光輸出能量60%、激光光斑55 μm、激光線性剝蝕IAEA-CH-7長(zhǎng)度300 μm條件下，（剝蝕出～150 ng碳），考察不同冷阱富集時(shí)間對(duì)可捕集到樣品量的影響。由圖2可見(jiàn)，冷阱富集50 s時(shí)，樣品捕集基本完成。綜合考慮空白背景影響和分析效率因素，選擇樣品捕集時(shí)間為50 s。

3.2.2 剝蝕樣品量

對(duì)IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜進(jìn)行不同長(zhǎng)度剝蝕，測(cè)試?yán)溱甯患瘲l件對(duì)樣品量的容納程度，如圖3所示，冷阱捕集50 s條件下，剝蝕線性長(zhǎng)度為50～500 μm（樣品峰面積2.5～10.87 V s），與同位素質(zhì)譜捕獲的峰面積呈線性相關(guān)（R2=0.991），表明此冷阱富集條件對(duì)該信號(hào)范圍內(nèi)的樣品峰可基本實(shí)現(xiàn)完全富集。

3.2.3 激光能量 由于IAEA-CH-7聚乙烯塑料膜形態(tài)相對(duì)特殊，相對(duì)薄而容易被擊穿，在驗(yàn)證激光能量時(shí)，選擇了常規(guī)EA-IRMS常用的粉末狀標(biāo)物IAEA 600（半胱氨酸）并對(duì)其壓片后測(cè)試。壓片后的樣品厚度可控，形態(tài)如圖4A所示。連續(xù)調(diào)整激光輸出能量，

由20%調(diào)整至100%（20%以下無(wú)法剝蝕出足夠樣品），重復(fù)3次。激光能量對(duì)同位素比值的影響見(jiàn)圖5，激光能量<50%時(shí)，同位素比值整體偏正;激光能量>50%時(shí)，同位素比值趨于恒定。有研究表明[7]，激光能量密度需高于樣品的剝蝕閾值，能量過(guò)低會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的元素分餾效應(yīng)。由圖5可推測(cè)，激光能量<50%時(shí)，對(duì)輕質(zhì)量的同位素產(chǎn)生質(zhì)量歧視;當(dāng)激光能量>50%時(shí)，方可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行完整剝離，獲得穩(wěn)定的、能夠反應(yīng)基體真實(shí)同位素比值的樣品。研究結(jié)果也表明，激光能量密度亦影響氣溶膠顆粒尺寸，低能量激光傾向形成小尺寸顆粒氣溶膠，利于傳輸和離子化。綜合考慮尺寸因素，規(guī)避分餾效應(yīng)，選擇在激光能量60%的輸出條件下對(duì)樣品進(jìn)行剝蝕。

值得注意的是，文獻(xiàn)[8]指出激光剝蝕光斑大小同樣會(huì)影響元素的分餾效應(yīng)，激光光斑越小，分餾因子越大，可能與激光剝蝕頻率和剝蝕直徑共同影響的剝蝕坑形狀有關(guān)。本研究結(jié)果表明，激光光斑大小對(duì)穩(wěn)定同位素比值存在顯著影響，但在恒定光斑尺寸下，同位素比值恒定，可以認(rèn)為此影響可作為整套設(shè)備的系統(tǒng)誤差通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行校正。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試

在激光能量60%、光斑55 μm、冷阱捕集50 s、剝蝕線性長(zhǎng)度300 μm條件下，對(duì)IAEA-CH-7和壓片后的IAEA 600和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)Urea重復(fù)測(cè)試，剝蝕痕跡電鏡圖見(jiàn)圖4，平行樣剝蝕尺寸、形狀和深度基本可控。3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平均峰面積分別為6.7、10.7 和3.7 V s，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15‰、0.07‰和0.18‰，精度滿足測(cè)試要求。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)采用元素分析-同位素質(zhì)譜測(cè)試（Element analyzer-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS），結(jié)果見(jiàn)表1和圖6。分別以兩種測(cè)試結(jié)果與真值作圖，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以EA-IRMS測(cè)試線性相關(guān)系數(shù)R2=1，而LA-IRMS方法測(cè)試的樣品用量?jī)H為元素分析方法樣品用量的萬(wàn)分之一，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992。

另外，對(duì)IAEA 600在同一個(gè)剝蝕痕跡槽內(nèi)重復(fù)剝蝕，以檢驗(yàn)上一次剝蝕是否存在質(zhì)量歧視，或是否導(dǎo)致基質(zhì)同位素比值發(fā)生變化。選擇兩個(gè)點(diǎn)位，在每個(gè)點(diǎn)位連續(xù)重復(fù)剝蝕5次，均值分別為27.69±0.16和27.78±0.19，在誤差范圍內(nèi)，可認(rèn)為剝蝕過(guò)程并未產(chǎn)生同位素分餾。

3.4 同位素標(biāo)記的水稻葉片微區(qū)測(cè)試

選擇以13C標(biāo)記的CO2培養(yǎng)的水稻葉片尖部，進(jìn)行微區(qū)碳同位素分布測(cè)試（圖4和圖7）。在1 mm寬的葉尖橫面，從右到左，依次間隔剝蝕取樣8次，平行兩次。剝蝕后的葉片電鏡圖和碳同位素測(cè)試結(jié)果如圖7所示。每個(gè)取樣點(diǎn)為55 μm直徑的圓孔，同一葉片在相同培養(yǎng)條件下，不同區(qū)域?qū)?3C標(biāo)記的CO2吸收效率不同，呈現(xiàn)中間和邊緣貧化、兩端富集的趨勢(shì)。水稻葉片中心葉脈和葉片邊緣處對(duì)標(biāo)記的13CO2吸收相對(duì)較弱，而兩邊葉肉部分對(duì)13CO2 吸收較強(qiáng)，即葉肉部分光合作用和呼吸作用強(qiáng)于葉脈和葉緣。研究表明[9]，植物13CO2短期動(dòng)態(tài)存在同種植物不同器官的差異，植物葉片呼吸釋放CO2碳同位素組成有較大的差異，變化幅度大于樹(shù)干/莖呼吸釋放。本研究在葉肉，葉脈和葉緣微觀尺度上研究植物呼吸釋放CO2的行為差異，此差異細(xì)節(jié)有望為環(huán)境生態(tài)研究人員提供關(guān)于植物呼吸、營(yíng)養(yǎng)吸收，光合作用等生態(tài)過(guò)程更詳細(xì)的信息，使植物生長(zhǎng)過(guò)程可視化。

4 結(jié) 論

將激光剝蝕取樣技術(shù)與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用，用于微區(qū)有機(jī)碳同位素測(cè)試。自行研制了激光剝蝕與同位素連用接口，定制了多重載氣過(guò)濾裝置和低流速微型樣品池，以微量高溫反應(yīng)爐將剝蝕出的氣溶膠在線轉(zhuǎn)化為CO2，并采用雙冷阱對(duì)轉(zhuǎn)化后的CO2進(jìn)行富集和聚焦。該套設(shè)備獲得了超低空白信號(hào)，并有效避免了激光剝蝕技術(shù)在傳輸和離子化過(guò)程產(chǎn)生的分餾。分析樣品量?jī)H需數(shù)十納克，為傳統(tǒng)元素分析同位素質(zhì)譜分析方法樣品量的萬(wàn)分之一，而測(cè)試精度相近。對(duì)13C標(biāo)記的水稻葉片尖進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，葉緣、葉脈對(duì)CO2交換速率低于葉肉區(qū)域。激光剝蝕取樣與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠原位、在線獲得動(dòng)植物等生態(tài)樣品碳同位素空間分布信息，分辨率低至50 μm，在環(huán)境、農(nóng)林、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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