傅桂瑜， 李 磊， 林鄭忠， 黃志勇

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine，SM2)是對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)類(lèi)藥物的一種，該類(lèi)藥物與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合二氫葉酸合成酶，進(jìn)而影響細(xì)菌核蛋白合成而發(fā)揮抑菌作用。該類(lèi)藥具有抗菌譜廣、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但當(dāng)其在人體內(nèi)殘留量達(dá)到一定水平時(shí)，會(huì)產(chǎn)生“三致”作用[1]，引起肝中毒、尿結(jié)石、腎衰竭或者過(guò)敏反應(yīng)等[2-4]。原農(nóng)業(yè)部第235 號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，SM2在牛奶中的最高殘留量為25 μg /kg。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，牛奶中SM2殘留的檢出率高達(dá)20%，高于其他各類(lèi)藥物殘留[5]，因此很有必要開(kāi)展食品中磺胺類(lèi)藥物殘留的日常監(jiān)測(cè)。

目前，食品中磺胺類(lèi)藥物的識(shí)別、檢測(cè)主要還是基于高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[3-4]和化學(xué)檢測(cè)法[6]。HPLC法常用的前處理若采用傳統(tǒng)的萃取方法，效率較低，而采用分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)作為識(shí)別材料可以提高效率。分子印跡技術(shù) (molecular imprinted technique，MIT)又稱(chēng)為分子模板技術(shù)，是將印跡分子與功能單體通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)作用形成穩(wěn)定的結(jié)合位點(diǎn)，在一定條件下加入交聯(lián)劑發(fā)生共聚反應(yīng)使之形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，最后將印跡分子從網(wǎng)狀聚合物中去除，形成了具有對(duì)印跡分子特異性識(shí)別的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)[7-8]。MIT因其較高的選擇性、親和性，良好的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，較長(zhǎng)的使用壽命，具有可檢測(cè)復(fù)雜樣品和微量物質(zhì)的優(yōu)越性，在生物醫(yī)藥、環(huán)境分析和食品安全方面都具有良好的發(fā)展前景。MIP本身沒(méi)有檢測(cè)功能，所以MIP通常被作為固相萃取填料，對(duì)靶標(biāo)物進(jìn)行富集后再結(jié)合其他手段檢測(cè)。李玲等[9]采用本體聚合法合成了一種二甲基嘧啶的MIP，利用分子印跡固相萃取高效液相色譜連用技術(shù)檢測(cè)磺胺類(lèi)獸藥殘留，MIP對(duì)模板分子的吸附量為11.37 mg/g。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但步驟繁瑣，且固相萃取柱對(duì)痕量SM2的萃取效率低，不利于后續(xù)的檢測(cè)分析。魏曉兵[10]制備了一種分子印跡聚合物/氧化石墨烯復(fù)合材料MIP/GO,并將其作為一種新型分子印跡固相萃取吸附劑，所制備的材料對(duì)SM2的吸附量是傳統(tǒng)MIP吸附量的1.5倍,可以實(shí)現(xiàn)痕量物質(zhì)的有效富集，并結(jié)合HPLC對(duì)SM2殘留進(jìn)行檢測(cè)。以上制備的MIP固相萃取填料對(duì)靶標(biāo)物具有高效識(shí)別能力，相比傳統(tǒng)的填料，簡(jiǎn)化了前處理流程，提高了效率。但傳統(tǒng)MIP在合成后為塊狀物質(zhì)，還需要人工研磨或其他措施才能使用，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。另外，研磨過(guò)程會(huì)造成一部分識(shí)別位點(diǎn)失效，且顆粒大小不均勻，吸附量不穩(wěn)定[11]。因此，在保留傳統(tǒng)MIP高效識(shí)別能力的基礎(chǔ)上，尋找一種合成和使用過(guò)程簡(jiǎn)單的吸附材料用于SM2的選擇性富集很有必要。

本文以SM2為模板分子，采用沉淀聚合法制備了一種對(duì)SM2具有特異性識(shí)別的MIP，制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，得到的聚合物粒徑小、顆粒均勻、選擇性好、吸附速度較快，并能重復(fù)利用，能作為一種SM2的富集材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SM2、磺胺胍(sulfaguanidine，SG)、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine，SDM)、磺胺噻唑(sulfathiazole，ST)均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃(tetrahydrofuran，HF)、乙酸、過(guò)氧化氫、濃硫酸、溴化鉀均購(gòu)于廣東西隴科學(xué)股份有限公司；甲基丙烯酸(methacrylic acid，MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(glycol dimethacrylate，EGDMA)均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；偶氮二異丁腈(azodiisobutyronitrile，AIBN)購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。以上試劑除了溴化鉀是色譜純外，其他都是分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)(Lambda 265，上海珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司)；傅里葉紅外光譜儀(Thermo Fisher scientific，IS50 FT-IR)；透射電鏡(日本電子株式會(huì)社，JEM-2010)；真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療企業(yè)制造有限公司，DZF-6030)；恒溫水浴鍋(廈門(mén)億辰科技有限公司，ZNCL-G15)；純水機(jī)(Sartorius，Comfort I)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SM2-MIP的制備

采用沉淀聚合法制備SM2-MIP。準(zhǔn)確稱(chēng)取模板分子SM20.14 g，倒入100 mL的具塞圓底燒瓶中，加50 mL的乙腈溶解，加入0.17 mL的功能單體MAA，超聲溶解后，4 ℃條件下靜置12 h，便于氫鍵的充分形成。加入1.92 mL的交聯(lián)劑EGDMA以及引發(fā)劑AIBN 100 mg，超聲10 min后，通N210 min，脫除溶液中的氧氣。加塞密封，60 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)24 h，磁力攪拌600 r/min。將制備得到的乳白色沉淀以8 000 r/min離心10 min。沉淀用V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1的溶液反復(fù)清洗，直到上清液中檢測(cè)不到SM2為止。得到的聚合物用甲醇浸泡12 h，去除聚合物中的殘留乙酸。在40 ℃條件下真空干燥6 h得到聚合物，將其研磨成粉末狀，得到SM2分子印跡聚合物(SM2-MIP)，密封保存，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用。制備空白聚合物(SM2-NIP)時(shí)，不加入SM2，其他過(guò)程與MIP制備的過(guò)程完全相同。

1.3.2 模板分子與功能單體相互作用

模板分子SM2和功能單體MAA以物質(zhì)的量比為1∶4溶于乙腈中，模板分子的初始濃度為0.01 mmool/L，預(yù)聚反應(yīng)12 h。采用紫外分光光度法在200～350 nm范圍內(nèi)掃描紫外吸收曲線(xiàn)。

1.3.3 動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取SM2-MIP/NIP 20 mg，加入到5 mL 20 mg/L的SM2溶液中(平行三組)，間隔5,10,20,30,60,90,120,150 min后，將吸附體系離心，取上清液2 mL測(cè)定其紫外吸光度值，計(jì)算其吸附量Q，并作SM2-MIP的動(dòng)力學(xué)吸附曲線(xiàn)。

1.3.4 等溫吸附曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取SM2-MIP/NIP 20 mg，分別加到5 mL的5，10，15，20，25，30 mg/L的SM2溶液中(平行三組)，吸附2 h后將吸附體系離心，取上清液2 mL測(cè)定其紫外吸光度值，計(jì)算其吸附量Q,并作SM2-MIP的等溫吸附曲線(xiàn)。

1.3.5 聚合物的吸附性能測(cè)定

在優(yōu)化條件下，用制備好的SM2-MIP/NIP吸附不同質(zhì)量濃度的SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液(5～20 mg/L),并記錄其相應(yīng)的吸光度值變化，并計(jì)算其吸附量Q(mg/g)，通過(guò)SM2的濃度C與Q作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.6 聚合物的表征

1)紅外光譜測(cè)定：分別稱(chēng)取1 mg的SM2-MIP/NIP 干燥粉末，與200 mg KBr均勻混合研磨，壓片后用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定其紅外光譜。

2)透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)形態(tài)測(cè)定：取一定量的SM2-MIP，用甲醇稀釋到一定濃度，超聲30 min后，取一定量的稀釋液滴加到硅片上，自然晾干后噴金。用JEM-2010透射電鏡表征聚合物微球的表面形貌，并用Nano Measurer 1.2對(duì)其進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 聚合物的選擇性研究

本實(shí)驗(yàn)選擇與SM2結(jié)構(gòu)相似的SG、SDM、ST為干擾項(xiàng)，分別用制備好的SM2-MIP/NIP聚合物對(duì)SM2、SG、SDM、ST的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸附，觀察其吸光度值的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板分子與功能單體相互作用

功能單體與模板分子相互作用力的大小決定著MIPs的選擇識(shí)別能力。因此，通過(guò)分析預(yù)聚體系中二者之間的相互作用是選擇功能單體最簡(jiǎn)單、快速的方法。圖1為模板分子，MAA，模板分子與MAA作用的紫外吸收譜線(xiàn)。由圖1可以看出，預(yù)聚體系的吸收值明顯小于模板分子，這說(shuō)明功能單體與模板分子存在著一定的相互作用。如MAA的羧基和模板的胺基可以形成較強(qiáng)的氫鍵，同時(shí)也能形成離子鍵。MIP對(duì)模板的高選擇性主要?dú)w功于這些相互作用力。

2.2 動(dòng)力學(xué)吸附曲線(xiàn)

為了測(cè)定SM2-MIP對(duì)溶液中SM2分子吸附飽和程度隨時(shí)間的變化，本實(shí)驗(yàn)固定SM2的質(zhì)量濃度為20 mg/L，測(cè)定不同時(shí)間下的MIP/NIP吸附量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，MIP和NIP的動(dòng)力吸附曲線(xiàn)主要分為兩部分，90 min以前，吸附量隨著時(shí)間的推移不斷增加；90 min以后吸附量逐漸趨于平穩(wěn)，達(dá)到飽和狀態(tài)。這是由于印跡位點(diǎn)有淺穴和深穴之分，在90 min以前主要以淺穴吸附為主，吸附速度較快；90 min之后以深穴吸附為主，同時(shí)由于印跡分子向深穴傳質(zhì)過(guò)程中受到空間位阻的作用，吸附變慢，達(dá)到飽和狀態(tài)。對(duì)比MIP和NIP，兩者有著同樣的吸附飽和時(shí)間。

2.3 等溫吸附曲線(xiàn)

以聚合物的吸附量Q對(duì)吸附溶液的初始濃度C作圖，得到MIP/NIP的等溫吸附曲線(xiàn)，如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，隨著吸附濃度的增大，MIP的吸附量隨之增加，當(dāng)吸附液質(zhì)量濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，MIP吸附量達(dá)到平衡。這是由于在合成聚合物的過(guò)程中，聚合物形成了與模板分子SM2結(jié)構(gòu)相匹配的空間構(gòu)型，即相應(yīng)功能基團(tuán)排列形成的印跡位點(diǎn)。這種印跡空穴對(duì)模板分子具有一定的“記憶功能”，會(huì)對(duì)模板分子進(jìn)行選擇性吸附。同時(shí)，NIP的吸附量隨著吸附濃度的增加也隨之增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)吸附達(dá)到平衡。這表明聚合物除了對(duì)模板分子的特異性吸附外，還存在一定的非特異性吸附能力，這是由于聚合物表面殘留的功能基團(tuán)，會(huì)與模板分子形成氫鍵所致。MIP和NIP的吸附量差異隨著濃度的增加而增加，這也充分表明了MIP的印跡空穴的存在。

為了評(píng)價(jià)分子印跡聚合物的識(shí)別性能，用MIP對(duì)SM2的等溫吸附數(shù)據(jù)作 Scatchard數(shù)據(jù)分析。Scatchard方程[12]為Q/C=(Qmax-Q)/Kd，其中：Q是MIP對(duì)SM2的吸附量(mg/g)；C是SM2的平衡質(zhì)量濃度(g/L)；Qmax是結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量(mg/g)；Kd是結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)(g/L)。以Q/C對(duì)Q作圖，如圖4，圖4中分別存在2條線(xiàn)性關(guān)系較好的線(xiàn)，說(shuō)明合成的聚合物存在著兩類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)斜率和截距[13]得知:聚合物對(duì)SM2的低親和性結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)Kd1=8.06 g/L，最大結(jié)合量Qmax1=6.62 mg/g；高親和性位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)Kd2=1.65 g/L，最大結(jié)合量Qmax2=3.86 mg/g。結(jié)合位點(diǎn)的形成與模板、功能單體的相互作用力有關(guān)，高親和性結(jié)合位點(diǎn)可能是氫鍵起主要作用，而低親和性位點(diǎn)可能是靜電力起主要作用[14]。

2.4 聚合物的響應(yīng)性

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MIP吸附不同濃度的SM2溶液，根據(jù)吸附后的吸光度值的不同，計(jì)算得到不同的吸附量Q。發(fā)現(xiàn)在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5～20 mg /L)，吸附量Q與吸附的濃度C有一定的線(xiàn)性關(guān)系，如圖5所示。并根據(jù)其相關(guān)性得到線(xiàn)性方程為：Q=0.145 1C+0.227 1，R2=0.997 9。

2.5 聚合物的表征

通過(guò)TEM表征，由圖7可以看出，MIP聚合物微球成不規(guī)則球形，MIP平均粒徑在368 nm，NIP的平均粒徑在355 nm。由于筆者改進(jìn)了聚合方法，提高了微球的規(guī)整性和尺寸的均勻性，這有利于提高M(jìn)IP的吸附穩(wěn)定性。

2.6 聚合物的選擇性

為了表明SM2-MIP對(duì)SM2的選擇性吸附性能，本實(shí)驗(yàn)選擇了4種與模板分子SM2結(jié)構(gòu)相似的磺胺為底物，分別用制備好的SM2-MIP/NIP聚合物對(duì)SM2、SG、SDM、ST的25 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其吸光度值，結(jié)果如圖8所示。由圖8可見(jiàn)，從吸附量Q來(lái)看，SM2-MIP對(duì)SM2的吸附量最大，對(duì)SDM、ST、SG的吸附量逐漸降低。這是由于SDM與SM2的空間構(gòu)型最相似，與MIP的印跡空穴能夠形成良好的互補(bǔ)作用[16]。ST、SG與SM2的空間構(gòu)型相似度不如SDM，與印跡空穴的互補(bǔ)程度較差，所以吸附量較低。比較4組吸附體系，MIP與NIP均存在一定的吸附差異，表明MIP與NIP在空間結(jié)構(gòu)上確實(shí)存在差異。

2.7 重復(fù)利用性

將吸附達(dá)到飽和后的MIP/NIP用V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1進(jìn)行洗脫，直至洗脫后上清液用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出SM2為止。真空干燥后再次吸附25 mg/L的SM2溶液，多次重復(fù)利用后，測(cè)定其吸附能力的變化,結(jié)果如圖9所示。由圖9可見(jiàn)，SM2-MIP經(jīng)過(guò)4次洗脫后，依然有良好的選擇性吸附能力，但是隨著洗脫次數(shù)的增加，MIP的吸附能力有所下降，可能是由于MIP的印跡空穴在洗脫過(guò)程中被破壞，導(dǎo)致其選擇性吸附減弱。NIP在4次洗脫后，其吸附能力基本不變，這是由于其不存在印跡空穴，洗脫對(duì)其吸附能力基本沒(méi)有影響。

3 結(jié)論

本文采用沉淀聚合法，以SM2為模板分子，MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，制備了SM2分子印跡聚合物，并對(duì)其吸附性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，聚合物的吸附量Q與吸附液質(zhì)量濃度C有一定的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為：Q=0.145 1C+0.227 1，R2=0.997 9。并且制備的聚合物對(duì)SM2有著良好的選擇吸附性和重復(fù)利用性，洗脫5次依然具有良好的選擇性。