連躍斌，許 凱，王文磊，徐 燕，紀(jì)德華，陳昌生，謝潮添

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

全球紫菜的年總產(chǎn)值約為20億美元，而我國(guó)的紫菜產(chǎn)量位居世界第一，2017年全國(guó)的紫菜產(chǎn)量達(dá)17.3×104t[1]，其中，壇紫菜(Pyropiahaitanensis)的產(chǎn)量約占全國(guó)紫菜產(chǎn)量的75%，產(chǎn)業(yè)規(guī)模巨大，經(jīng)濟(jì)效應(yīng)可觀[1]。然而，近年來(lái)隨著壇紫菜養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大，廣大養(yǎng)殖戶仍以傳統(tǒng)方式進(jìn)行生產(chǎn)，以未經(jīng)選育的野生種為主要栽培品種，造成壇紫菜種質(zhì)嚴(yán)重退化、產(chǎn)量降低、質(zhì)量下降等問(wèn)題[2]。因此，優(yōu)良品種的選育勢(shì)在必行。

壇紫菜葉片是四分子嵌合體，一株葉狀體上最多可以有四種顏色。經(jīng)過(guò)嵌合再純化的色素突變體可作為體色標(biāo)記性狀，并廣泛用于純系選育。壇紫菜色素突變體在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值日益體現(xiàn)。嚴(yán)興洪和王素娟[3]使用秋水仙堿對(duì)壇紫菜的體細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，得到了形狀細(xì)長(zhǎng)、顏色深、生長(zhǎng)較快的紅色突變體。嚴(yán)興洪[4]利用紫外線輻射，對(duì)條斑紫菜(Porphyrayezoensis)和壇紫菜的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，經(jīng)照射后，產(chǎn)生的后代原生質(zhì)體顏色呈紅色，并出現(xiàn)一些生長(zhǎng)速度更快、長(zhǎng)寬比更小的純紅色突變體后代。有賀祐勝等[5]在條斑紫菜紅色突變體的研究中表明，紅色突變體與野生型比較，藻紅蛋白含量高，藻藍(lán)蛋白含量低，葉綠素a差異不大，所以藻體呈現(xiàn)紅色。徐燕[6]通過(guò)60Co-γ射線輻射壇紫菜自由絲狀體，從誘變絲狀體子代中選育性狀優(yōu)良的色素突變體，將誘變品系和野生選育品系進(jìn)行雜交，之后利用體細(xì)胞克隆技術(shù)將單一色塊酶解，誘導(dǎo)產(chǎn)生絲狀體進(jìn)而發(fā)育為完整的紫菜葉狀體，經(jīng)過(guò)四代選育，最終獲得了一個(gè)優(yōu)良紫菜純系新品種(閩豐1號(hào))，該品種藻體日均增重快、耐高溫、藻體寬而薄且不易老化。梁艷[7]在對(duì)壇紫菜(閩豐1號(hào))的研究中證明，葉狀體的藻膽蛋白含量均極顯著地高于對(duì)照組，藻膽蛋白含量是對(duì)照組的2.14倍，其中藻紅蛋白含量占比較大，葉綠素a含量同樣顯著高于對(duì)照組。在生產(chǎn)中，紫菜藻體的色澤是衡量紫菜菜餅干制品品質(zhì)高低的重要指標(biāo)，而已有的研究結(jié)果表明紫菜的色澤主要是由其藻體中光合色素的含量和比例決定的[8]。由此可見(jiàn)，探究紫菜色素突變體的形成原因就顯得尤為重要。

影響高等植物顏色形成的色素主要是花青素、類胡蘿卜素、甜菜紅素和葉綠素。然而，在藻類中影響顏色形成的色素主要是藻膽蛋白和葉綠素。光合色素(Chla、PE、PC&APC)的含量和相互之間的比例決定了紫菜的質(zhì)量和藻體的顏色[9-10]。谷氨酰-tRNA還原酶(Glutamyl-tRNA reductase，hemA)是卟啉合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，能夠催化谷氨酸合成5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)[11]。ALA可以調(diào)節(jié)Chla的合成[12-14]，提高Chla和捕光系統(tǒng)II的穩(wěn)定性[15]。例如，添加ALA可以促進(jìn)小球藻(Chlorellavulgaris)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的色素合成與藻體生長(zhǎng)[16]。姚嘉龍等[17]對(duì)擬南芥(Arabidopsis)的研究表明，hemA基因在Chla生物合成過(guò)程中表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明相關(guān)酶合成減少，導(dǎo)致Chla合成減少。在番茄色素合成中，過(guò)剩的血紅素影響細(xì)胞內(nèi)色素的含量和比例，會(huì)引起色素突變[18]。在Synechococcussp.PCC7002藻藍(lán)蛋白操縱子閱讀框cpcF和cpcE中任意位點(diǎn)插入突變，都會(huì)產(chǎn)生相同表現(xiàn)型的突變株，相對(duì)于野生型來(lái)說(shuō)這種突變株產(chǎn)生極少的藻藍(lán)蛋白，而且所產(chǎn)生的藻藍(lán)蛋白缺少α-84位上的藻藍(lán)膽素[19]。小球藻的研究發(fā)現(xiàn)，由于突變體在葉綠素Mg2+鰲合酶基因表達(dá)缺陷，造成突變體Chla合成缺陷，最終造成小球藻Chla含量減少和藻體顏色黃化[20]。

然而，目前關(guān)于紫菜色素合成通路以及色素突變體產(chǎn)生的分子機(jī)理尚不清楚[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)從色素合成通路出發(fā)，結(jié)合相關(guān)色素含量測(cè)定和色素合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平分析，探究壇紫菜顏色形成的分子機(jī)制，為進(jìn)一步理解紫菜等大型海藻的顏色形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常培養(yǎng)條件：溫度(21±0.5)℃，光照強(qiáng)度50～60 μmol/(m2·s)，光照周期12L∶12D，在新鮮海水中培育，每3天更換1次海水。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 色度值測(cè)量

從每個(gè)突變體中隨機(jī)選取3株作為實(shí)驗(yàn)材料。藻體平攤于白色濕潤(rùn)瓷盤上，用CM-700d分光測(cè)色計(jì)(柯尼卡美能達(dá)，Konica Minolta 控股公司，日本)垂直于藻體，測(cè)量藻體的中部，取色度值a值和b值。a值越大表示藻體顏色越偏紅色，a值越小表示藻體顏色越偏綠色；b值越大表示藻體顏色越偏黃色，b值越小表示藻體顏色越偏藍(lán)色。

1.3 葉綠素和藻膽蛋白的測(cè)定

1.3.1 葉狀體藻膽蛋白含量的測(cè)定

藻膽蛋白含量測(cè)定，參照文獻(xiàn)[22]：1)分別取6份在生長(zhǎng)旺期冰凍保存的葉狀體藻體，將其中3份藻體稱取鮮重(WF)后置于105 ℃烘箱中干燥2 h，再稱取干重(WD)，測(cè)定藻體的含水率(WC)；2)取另3份藻體在避光環(huán)境中，在倒有液氮的研缽中充分研磨至粉末狀，將粉末倒入50 mL凍存管中，分別加入適量的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=6.8)浸泡數(shù)分鐘后，用磷酸鈉緩沖液沖洗研缽3次以上，將凍存管中液體總體積控制在25 mL左右，用鋁箔包裹避光；3)將凍存管放入-20 ℃冰箱中冷凍，待完全冰凍后，取出凍存管于室溫下避光解凍，反復(fù)凍融6次以上，放入4 ℃冰箱中過(guò)夜，徹底提取藻膽蛋白；4)用300目篩絹網(wǎng)將研磨液過(guò)濾至50 mL離心管中，用磷酸鈉緩沖液沖洗凍存管，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min。取上清液，在錫箔紙包裹的容量瓶中定容至50 mL(V)，搖勻后靜置至室溫；5)用分光光度計(jì)測(cè)定其在565 nm、615 nm、650 nm和730 nm波長(zhǎng)下的OD值(A)。利用公式分別計(jì)算1 g藻體中藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)和別藻藍(lán)蛋白(APC)的含量w(mg/g):

w(PE)=[0.123(A565-A730)-0.068(A615-A730)+0.015(A650-A730)]×V/[WF(1-WC)]，

w(PC)=[0.162(A615-A730)-0.001(A565-A730)-0.098(A650-A730)]×V/[WF(1-WC)]，

w(APC)=[0.171(A650-A730)-0.006(A565-A730)-0.004(A615-A730)]×V/[WF(1-WC)]。

1.3.2 葉狀體Chla含量的測(cè)定

Chla含量測(cè)定，參照文獻(xiàn)[23]：1)分別取6份在生長(zhǎng)旺期冰凍保存的葉狀體藻體， 將其中3份藻體稱取鮮重(WF)置于105℃烘箱中干燥2 h后再稱取干重(WD)，測(cè)定藻體的含水率(WC)；2)另取3份藻體在避光環(huán)境中，在倒有液氮的研缽中充分研磨至粉末狀，將粉末倒入40 mL錫箔紙包裹的凍存管中，加入適量90%的丙酮溶液浸泡3分鐘，用90%的丙酮溶液沖洗研缽3次以上，蓋上瓶蓋；3)在室溫下，置于避光處24 h，徹底提取Chla，用300目篩絹網(wǎng)將研磨液過(guò)濾至50 mL離心管中，于4℃、10 000 r/min離心20 min；4)取上清液，在錫箔紙包裹的容量瓶中定容至50 mL(V)，搖勻；5)用分光光度計(jì)測(cè)定其在666 nm、730 nm波長(zhǎng)下的OD值(A)，計(jì)算每克藻體中Chla的含量(mg/g),ω(Chla)=(A666-A730) ×10V/(890(WF(1-WC))。

1.4 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.4.1 RNA提取

利用E.Z.N.Z植物提取試劑盒(OMEGA，德國(guó))提取不同顏色突變體樣品RNA。

1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取樣品總RNA后，將完整性均好，無(wú)雜質(zhì)污染的RNA樣品，由深圳華大基因股份有限公司利用BGISEQ-500高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)，然后本研究完成后續(xù)的數(shù)據(jù)拼接組裝與分析。

1.4.3 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

測(cè)序得到的reads，通過(guò)如下步驟處理獲得clean reads：1)去除含有測(cè)序接頭的reads；2)去除比例大于10%的reads；3)去除低質(zhì)量的reads(質(zhì)量Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)reads的50%以上)；4)獲得clean reads。

1.4.4 Clean reads

使用無(wú)參轉(zhuǎn)錄組組裝軟件Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行無(wú)參考組裝，得到壇紫菜Unigene。對(duì)組裝出的Unigene進(jìn)行長(zhǎng)度分布、平均長(zhǎng)度、N50、組裝大小等測(cè)序指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)。

1.4.5 Unigene功能注釋

將組裝所獲得的Unigene序列通過(guò)序列比對(duì)軟件Blast+在7大數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr、Swissport、KEGG、GO、COG、KOG、Pfam)中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)而得到該Unigene的功能注釋信息。

1.4.6 基因表達(dá)量的計(jì)算

根據(jù)組裝結(jié)果，使用 Bowtie2 軟件把每個(gè)樣本的clean reads比對(duì)到Unigene，之后使用RSEM (reads per kb per million reads)計(jì)算每個(gè)樣品的基因表達(dá)水平。

1.4.7 差異表達(dá)基因的篩選

對(duì)經(jīng)過(guò)RSEM軟件比對(duì)得到的gene read count數(shù)據(jù)，用差異表達(dá)分析軟件edgeR進(jìn)行分析。顯著差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR(false discovery rate)<0.05&log2|FC|>=1，F(xiàn)為基因表達(dá)量，C為唯一比對(duì)到基因的片段數(shù)。

1.4.8 GO和Pathway顯著富集分析

首先把所有的差異基因向KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http:www.kegg.jp/)的各個(gè)Pathway映射，計(jì)算每個(gè)Pathway的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整合基因組差異表達(dá)基因顯著富集的Pathway。FDR≤0.05的Pathway定義為差異基因中顯著富集的Pathway。

1.5 聚類分析和熱圖分析

本研究中，在進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算時(shí)，采用計(jì)算FPKM值(fragments per kb per million reads)表示基因的相對(duì)表達(dá)量，F(xiàn)PKM值的計(jì)算方法是：FPKM=106C/(NL103)，N為唯一比對(duì)到參考基因的總片段數(shù)，L為基因長(zhǎng)度。

根據(jù)基因的注釋信息，選取色素合成通路上的關(guān)鍵基因，利用R語(yǔ)言gplots包(http:cran.r-project.org/web/packages/gplots/index.html)中的heatmap.2模塊對(duì)這些基因的表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析。對(duì)不同顏色的6組樣品在關(guān)鍵基因的不同表達(dá)水平作熱圖分析，并通過(guò)樣品之間兩兩對(duì)照比較各基因的表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件比較數(shù)據(jù)均值，并進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，以P>0.05為差異不顯著，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

用于送測(cè)的RNA樣品濃度介于500～1000 ng/μL之間，總量大于50 μg，A260/A280值在1.9～2.1之間，A260/A230值大于1.8。電泳結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示，所有樣品條帶完整、清晰、無(wú)拖尾，都具有2條 28 S，3條18 S，以及1條5 S條帶。

2.2 壇紫菜不同色素突變體的色度值測(cè)定

不同色素突變體的表觀顏色差異顯著，從色度值可以明顯看出來(lái)，不同顏色的品系的色度值區(qū)分明顯。橘色品系的a值平均值最大(21.95±0.29)，翠綠色品系的a值平均值最小(-6.90±0.24)。橘色品系與紅色品系的a值差異不明顯(P>0.05)，但橘色品系明顯高于紫色品系和野生品系(P<0.05)；棕綠色品系明顯比翠綠色品系的a值高(P<0.05)。因此，本研究將色度值相近的幾個(gè)品系歸為一類，分別為紅黃組和綠組，紅黃組包括橘色品系、紅色品系、紫色品系和野生品系，綠組包括翠綠色品系和棕綠色品系(見(jiàn)圖2A)。紅黃組的a值平均為(18.66±3.50)，綠組的a值平均為(-3.1±3.72)，兩組樣的差異明顯(見(jiàn)表1)(P<0.05)。而在b值平均值上，兩組樣品無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表1 紅黃組和綠組的色度值統(tǒng)計(jì)分析

說(shuō)明:上標(biāo)字母不相同表示顯著差異。

Note:Superscripts represent significant difference among treatments．

2.3 葉狀體藻膽蛋白和Chl a的含量

在PE含量方面，紅色品系含量最高，約為75 mg/g；紫色品系約為70 mg/g；橘色品系約為65 mg/g；野生品系約為50 mg/g；棕綠色品系和翠綠色品系的含量最少，分別為20 mg/g 和15 mg/g。在PC含量方面，紫色品系最多，約為27 mg/g；野生品系約為17 mg/g；棕綠色品系、翠綠色品系和紅色品約為10 mg/g；橘色品系約為2 mg/g。而對(duì)于APC而言，紫色品系和野生品系的含量最高，之后依次是棕綠色品系、翠綠色品系、橘色品系和紅色品系，其含量均不超過(guò)10 mg/g(見(jiàn)圖2a)。Chla含量測(cè)定結(jié)果顯示，翠綠色品系的Chla含量約為8 mg/g，顯著高于其他品系(P<0.05)，其中，棕綠色品系、橘色品系和野生品系約為6 mg/g，而紅色品系和紫色品系含量約為4 mg/g(見(jiàn)圖2b)。

通過(guò)各品系色素蛋白含量的比值可以發(fā)現(xiàn)：紫色和紅色品系的w(PE)/w(Chla)約為16，橘色品系的w(PE)/w(Chla)約為12，野生品系的w(PE)/w(Chla)約為9，翠綠色品系和棕綠色品系的w(PE)/w(Chla)均小于5。紫色品系的w(PC)/w(Chla)最高，約為6；橘色品系的w(PC)/w(Chla)最低，約為0.3。橘色品系的w(PE)/w(PC)最高，約為30；紅色品系w(PE)/w(PC)約為8.5；紫色品系、野生品系、棕綠色品系和翠綠色品系沒(méi)有顯著差異，w(PE)/w(PC)都不高于5(見(jiàn)圖2c)。

2.4 Chl a和藻膽蛋白合成關(guān)鍵酶的表達(dá)分析

通過(guò)相關(guān)基因表達(dá)水平的聚類分析發(fā)現(xiàn)，在橘色品系、紫色品系和棕綠色品系中hemA基因的表達(dá)水平較高(見(jiàn)圖3)。在Chla和藻膽蛋白的合成通路中，谷氨酰-tRNA經(jīng)由hemA等催化反應(yīng)生成5-氨基酮戊酸(ALA)(見(jiàn)圖4)，之后，5-氨基酮戊酸經(jīng)過(guò)催化合成原卟啉Ⅸ，再經(jīng)過(guò)Mg-鰲合酶(CHLI、CHLD 和CHLH)催化生成鎂原卟啉Ⅸ。在本實(shí)驗(yàn)中，Mg-鰲合酶在橘色品系、紫色品系和野生品系中的表達(dá)水平較高。此外，葉綠素合成酶(CHLG)是合成Chla的關(guān)鍵酶，鎂原卟啉Ⅸ經(jīng)過(guò)CHLG等一系列反應(yīng)生成Chla。本研究發(fā)現(xiàn)，CHLG在橘色品系、紅色品系、野生品系和翠綠色品系中顯著上調(diào)表達(dá)。

在藻膽蛋白的合成通路中，血紅素氧化酶(HMOX1)是催化血紅素合成膽綠素的關(guān)鍵酶，原卟啉Ⅸ經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成血紅素，血紅素再經(jīng)過(guò)HMOX1催化合成膽綠素。在本實(shí)驗(yàn)中，HMOX1在橘色品系、紫色品系、野生品系和棕綠色品系的表達(dá)水平高于其他品系。膽綠素再經(jīng)過(guò)鐵氧還蛋白氧化還原酶(HY2)等一系列反應(yīng)催化，最終合成藻膽蛋白。而HY2在橘色品系、紅色品系、野生品系和翠綠色品系中的表達(dá)水平較高。

3 討論

本研究中，紅黃組品系的平均PE含量比綠組高3.5倍，而PC和APC含量卻沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，紅黃組的平均Chla含量顯著低于綠組(P<0.05)，進(jìn)而造成兩組藻體在顏色上的差異。張倩[24]對(duì)皺紫菜(Pyropiacrispata)色素突變體的研究數(shù)據(jù)表明，紅色品系皺紫菜(PC-ZH)的PE含量明顯高于其他綠顏色的皺紫菜。黃慧珍[1]也發(fā)現(xiàn)，壇紫菜野生品系的PE含量是翠綠色品系的十多倍。本研究中，橘色、紫色、紅色和野生品系的w(PE)/w(Chla)高，其中橘色、紫色和紅色藻體的w(PE)/w(Chla)大于10，翠綠色和棕色品系的w(PE)/w(Chla)小于5。在色澤的差異上，橘色、紫色、紅色和野生品系a值顯著大于翠綠色和棕色品系，所以橘色、紫色、紅色和野生品系呈現(xiàn)紅色，而翠綠色和棕色品系呈現(xiàn)綠色。

在葉綠素和藻膽蛋白合成基因的表達(dá)中(見(jiàn)圖4)，橘色品系、紫色品系和棕綠色品系的hemA相關(guān)基因的表達(dá)水平較高，說(shuō)明壇紫菜藻體可能大量合成ALA，為Chla和藻膽蛋白的合成提供更多前體，有利于藻體的色素合成。李爽[25]將hemA基因克隆到pET28a載體上，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)分離純化得到谷氨酰tRNA還原酶。重組菌發(fā)酵液上清中ALA含量達(dá)40.2 mg /L，通過(guò)過(guò)篩試驗(yàn)和紫外分光光度檢測(cè)驗(yàn)證顯色物質(zhì)為卟啉類。

在合成通路后續(xù)反應(yīng)中，鎂離子鰲合酶催化合成鎂原卟啉Ⅸ，鎂離子鰲合酶是原卟啉Ⅸ合成鎂原卟啉Ⅸ的關(guān)鍵酶。在色素合成通路中，鎂離子鰲合酶催化鎂原卟啉Ⅸ的合成，決定了通路色素合成的走向(見(jiàn)圖4)。本研究在壇紫菜轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的CHLI、CHLD 和CHLH是鎂離子鰲合酶的亞基，參與組成鎂離子鰲合酶，進(jìn)而參與Chla的合成。小球藻突變體的研究中CHLI、CHLD和CHLH表達(dá)水平的降低，引起突變體Chla合成缺陷，導(dǎo)致小球藻突變體光合作用降低，最終造成突變體藻體顏色比野生型淺[1]。在本研究中，橘色品系和野生品系的CHLI、CHLD和CHLH基因表達(dá)水平高于其他品系(見(jiàn)圖3)。此外，通過(guò)紅黃組間比較，發(fā)現(xiàn)橘色品系和野生品系的Chla含量較高(見(jiàn)圖2b)，說(shuō)明藻體可能大量催化原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ)合成鎂原卟啉Ⅸ(Mg Protoporphyrin Ⅸ)，進(jìn)而合成Chla。在Chla合成通路中，CHLG是催化鎂原卟啉合成Chla的關(guān)鍵酶。在鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[26]和茶樹(shù)[27]的研究中均發(fā)現(xiàn)，CHLG表達(dá)水平的降低，會(huì)造成植株的黃化，生長(zhǎng)緩慢。在本研究中，野生品系和翠綠色品系CHLG基因表達(dá)水平較高，并且野生品系和翠綠色品系的Chla含量也高(見(jiàn)圖2b)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，油菜(BrassicanapusL.)中HMOX1的表達(dá)水平高，會(huì)抑制Chla的合成，轉(zhuǎn)向合成膽綠素，造成油菜失綠的現(xiàn)象[28]。牟鈺[29]對(duì)白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensis)的研究發(fā)現(xiàn)，血紅素加氧酶在血紅素代謝過(guò)程中限制了血紅素的降解，使血紅素含量積累，血紅素積累后抑制ALA的合成，ALA合成受阻致使葉綠素合成減少，最終導(dǎo)致葉色變異。

而紅藻在血紅素氧化酶(HMOX1)和鐵氧還蛋白氧化還原酶(HY2)等一系列生化反應(yīng)下，催化血紅素合成藻膽蛋白。Emborg等[30]發(fā)現(xiàn)擬南芥中血紅素加氧酶發(fā)生突變，使血紅素合成的光敏生色團(tuán)合成受阻。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)紅黃組藻體的HMOX1和HY2上調(diào)表達(dá)，而橘色品系、紅色品系、紫色品系和野生品系的PE含量明顯高于其他品系。

因此，本研究推測(cè)，HMOX1和HY2的高表達(dá)水平，可能會(huì)抑制Chla的合成，并大量合成膽綠素，最終導(dǎo)致藻體顏色上表現(xiàn)出失綠[28]。而在綠組中，棕綠色品系HMOX1的表達(dá)水平高于翠綠色品系，然而棕綠色品系在CHLG的表達(dá)水平卻低于翠綠色品系，最終導(dǎo)致棕綠色品系的PE含量顯著高于翠綠色品系(P<0.05)，而Chla含量低于翠綠色品系，進(jìn)而導(dǎo)致棕綠色品系比翠綠色品系的顏色更深。

4 結(jié)論

綜上所述，紅黃組品系藻體PE含量高導(dǎo)致w(PE)/w(Chla)高，綠組品系藻體Chla含量高導(dǎo)致w(PE)/w(Chla)低，從而導(dǎo)致紅黃組品系藻體呈現(xiàn)紅色，綠組品系藻體呈現(xiàn)綠色。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，綠組品系藻體中，Mg-鰲合酶和葉綠素合成酶表達(dá)水平上調(diào)，合成更多Chla，使得藻體呈綠色；紅黃組品系藻體中，血紅素合成時(shí)血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶上調(diào)，催化血紅素合成膽綠素，最終合成藻膽蛋白，促使藻體顏色變深，呈紅黃色。本研究有助于進(jìn)一步理解壇紫菜色素合成通路中關(guān)鍵酶的作用，為探究壇紫菜色素突變體的形成機(jī)制提供了理論依據(jù)。