欒曉瑾 顏一丹 陳 霞 王 敏 陳萬銀 鄭倩雯 謝 冰 于 駿 方 杰

稽留流產(chǎn)是指胚胎停止發(fā)育后仍滯留于宮腔內(nèi)無法自行排出，是早期妊娠的并發(fā)癥之一[1]。近年來稽留流產(chǎn)發(fā)生率逐漸攀升，高達(dá)15%～20%[2]?；袅鳟a(chǎn)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其病因主要涉及染色體異常、感染和自身免疫性疾病、內(nèi)分泌失調(diào)等方面[3]?；袅鳟a(chǎn)嚴(yán)重威脅了女性的健康，死亡的胚胎及病變的胎盤組織滯留于宮腔中釋放凝血活酶，易引發(fā)凝血功能紊亂[4]。清宮所導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜損傷會(huì)誘發(fā)宮腔粘連及不孕，給患者帶來巨大的心理傷害，故探索稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。

胎盤是在母體系統(tǒng)和胎兒系統(tǒng)之間運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、呼吸氣體和廢物的重要器官。胎盤的早期發(fā)育依賴于囊胚腔外圍的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的植入和侵襲[5]。有證據(jù)表明，稽留流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中凋亡及自噬的相關(guān)蛋白均有異常表達(dá)。肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子3α(FOXO3α)在稽留流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中均表達(dá)上調(diào)，提示滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致宮腔內(nèi)的死胎無法及時(shí)排除[6,7]。自噬過程關(guān)鍵因子Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在稽留流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中均上調(diào)，提示滋養(yǎng)細(xì)胞自噬增強(qiáng)參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生[8]。然而，由于滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和自噬功能異常而導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)病的具體機(jī)制尚未明確。有研究者對(duì)稽留流產(chǎn)患者和正常妊娠女性絨毛組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究和生物信息學(xué)分析，得到了51個(gè)差異表達(dá)的蛋白，其中免疫蛋白酶體亞基PSMB8(proteasome subunit beta 8)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FC=1.37，P<0.05)，可能是誘導(dǎo)稽留流產(chǎn)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子[9]。

PSMB8，又稱大型多功能蛋白酶7(large multifunctional protease 7，LMP7)，編碼蛋白酶體的β5i亞基[10]。細(xì)胞內(nèi)普遍存在的蛋白酶體是26S標(biāo)準(zhǔn)型蛋白酶體，由一個(gè)核心的20S蛋白酶體和兩個(gè)具有調(diào)節(jié)作用的19S蛋白酶體組成，水解大多數(shù)蛋白質(zhì)[11]。當(dāng)受到氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等刺激誘導(dǎo)時(shí)，20S蛋白酶體的β1、β2、β5亞基可相應(yīng)被β1i、β2i、β5i取代，并且與兩個(gè)11S調(diào)節(jié)亞基PA28組裝成免疫型蛋白酶體，增強(qiáng)蛋白酶體與主要組織相容性抗原(MHC-1)相結(jié)合多肽的能力[12]。對(duì)于清除細(xì)胞內(nèi)有害的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。研究表明，PSMB8對(duì)免疫型蛋白酶體的加工極為重要，它是β1i 和β2i 前肽翻譯后加工必不可少的[13]。目前，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其在稽留流產(chǎn)中的作用。本研究旨在探討PSMB8對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo(簡(jiǎn)稱HTR-8)凋亡及自噬能力的影響，初步探討PSMB8導(dǎo)致稽留流產(chǎn)可能的機(jī)制，以期為稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

材料與方法

1.材料與試劑：HTR-8細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)、1640培養(yǎng)液及Opti-Mem培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清及胰酶購(gòu)自以色列Bioind公司,Oligo-fectamineTM 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,PSMB8 siRNA質(zhì)粒及NC siRNA質(zhì)粒設(shè)計(jì)并購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司，TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒及CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自中國(guó)諾唯贊公司，Annexin Ⅴ Alexa Flμor647/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)福麥斯生物有限公司，caspase-3(cleaved)及LC3一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，488標(biāo)記抗兔IgG(H+L)熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR用SYBRGreen染料購(gòu)自日本TaKaRa公司，qRT-PCR引物購(gòu)自中國(guó)生工生物公司，Real-timePCR儀QuantStudio?5購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：HTR-8細(xì)胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100nmol/ml)、鏈霉素(100μmol/ml)的1640培養(yǎng)基，在37℃、含有5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。

3.PSMB8基因沉默處理：將HTR-8細(xì)胞按1.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作按脂質(zhì)體Oligo-fectamineTM 2000試劑說明書進(jìn)行。分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋不同體積的siRNA和轉(zhuǎn)染試劑，設(shè)置25、50、100 nmol/L濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每次轉(zhuǎn)染均設(shè)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無義空白鏈(NC) siRNA。轉(zhuǎn)染6h后換為完全培養(yǎng)基，48h后行qRT-PCR觀察結(jié)果以篩選出干涉效率較高的siRNA序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA信息描述詳見表1。

表1 siRNA序列

4.CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖：將HTR-8細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2.5×103個(gè)，待細(xì)胞貼壁后按材料與方法3進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入10μl CCK-8溶液并置于孵箱內(nèi)避光孵育1h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度值，每個(gè)樣本做3個(gè)副孔。

5.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染24h后的HTR-8細(xì)胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行試驗(yàn)操作，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)并拍照。用Image J記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，根據(jù)凋亡細(xì)胞數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況：用不含EDTA的胰酶收集6孔板中轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次后，用300μl結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml，每管加入2.5μl Annexin Ⅴ/Alexa Flμor 647 和5μl PI溶液染色，室溫避光孵育15min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.免疫熒光檢測(cè)caspase-3 (cleaved)和LC3蛋白的表達(dá)：將轉(zhuǎn)染24h后的HTR-8細(xì)胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。用4%多聚甲醛固定20min，用含0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的PBS清洗3次，每次10min，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉30min，分別加入caspase-3(cleaved)和LC3一抗于室溫孵育1h后再用含0.1% TritonX-100的PBS清洗3遍。再用二抗于室溫孵育1h，最后用含0.1% TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，用100μl 1.0mg/ml的Hoechst33342染DNA 15min后，用防熒光淬滅劑封片。HTR-8細(xì)胞免疫熒光圖片通過熒光顯微鏡采集，每幅圖像取3個(gè)不同視野，并根據(jù)陽性細(xì)胞率進(jìn)行分析。

8.qRT-PCR檢測(cè)PSMB8及自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平：將培養(yǎng)48h的兩組HTR-8細(xì)胞采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SYBR熒光染料、cDNA、引物用來配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，60℃退火20s，共40個(gè)循環(huán)。Ct值應(yīng)用2-ΔΔCt方法處理，每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量按照內(nèi)參的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。每個(gè)樣本有3個(gè)副孔，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。詳細(xì)的引物序列見表2。

結(jié) 果

1.PSMB8 siRNA干涉效率驗(yàn)證：與對(duì)照組比較，各siRNA轉(zhuǎn)染組PSMB8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，在100nmol/L siRNA的濃度下，PSMB8 siRNA-1的轉(zhuǎn)染效率最高，可下調(diào)約70%。因此，本研究選擇在HTR-8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染100nmol/L PSMB8 siRNA-1進(jìn)行后續(xù)的功能研究實(shí)驗(yàn)(圖1A)。

表2 qRT-PCR引物

2.PSMB8 siRNA抑制HTR-8細(xì)胞增殖：在HTR-8細(xì)胞內(nèi)沉默PSMB8基因后，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組細(xì)胞增殖能力減弱，兩組細(xì)胞450nm處吸光度值24h及48h之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 PSMB8 siRNA干涉效率驗(yàn)證及對(duì)HTR-8細(xì)胞增殖的影響A.對(duì)照組和PSMB8 siRNA組細(xì)胞中PSMB8 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；B.PSMB8表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000

3.PSMB8 siRNA促進(jìn)HTR-8細(xì)胞凋亡：TUNEL法檢測(cè)PSMB8 siRNA對(duì)HTR-8細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組的TUNEL陽性細(xì)胞比例增多(15.05±2.62 vs 33.40±2.44,P=0.000，圖2A、圖2C)。使用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3(cleaved)表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組中caspase-3(cleaved)蛋白陽性細(xì)胞比例增多(21.70±5.87 vs 53.29±10.29,P<0.01,圖2B、圖2D)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組中存活細(xì)胞明顯減少(89.10±0.78 vs 77.00±1.68,P=0.000)，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞所占比例增高(9.09±0.65 vs 10.71±0.61,P<0.05)，壞死細(xì)胞所占比例也增高(2.49±0.73 vs 12.49±2.02,P<0.01，圖3)。

圖2 PSMB8 siRNA導(dǎo)致HTR-8細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞增多A.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組進(jìn)行TUNEL檢測(cè)(×400)，TUNEL(紅色)，DNA(藍(lán)色)，標(biāo)尺50μm; B.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組進(jìn)行免疫熒光染色(×400)，caspase-3(cleaved)(綠色)，DNA(藍(lán)色)，標(biāo)尺50μm; C.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組中TUNEL陽性細(xì)胞率柱狀圖；D.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組中caspase-3(cleaved)陽性細(xì)胞率柱狀圖; *P<0.01，**P=0.000

圖3 流式檢測(cè)PSMB8 siRNA對(duì)HTR-8細(xì)胞凋亡的影響A.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡分布情況;B.細(xì)胞凋亡情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖; *P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

4.PSMB8 siRNA誘導(dǎo)HTR-8細(xì)胞自噬：使用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組中產(chǎn)生LC3蛋白熒光的細(xì)胞數(shù)量增加(19.02±3.78 vs 31.90±4.87,P<0.05)。qRT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因ULK1、Atg14、Atg5、Atg12、Atg3、Atg7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，與對(duì)照組比較，PSMB8 siRNA-1組中各基因mRNA表達(dá)均上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4 PSMB8 siRNA導(dǎo)致HTR-8細(xì)胞內(nèi)自噬水平增強(qiáng)A.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組進(jìn)行免疫熒光染色(×400)，LC3(綠色)，DNA(藍(lán)色)，標(biāo)尺50μm; B.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組中LC3陽性細(xì)胞率柱狀圖; C.對(duì)照組和PSMB8 siRNA-1組中自噬相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱狀圖; *P<0.05，**P<0.01

討 論

滋養(yǎng)細(xì)胞在多種機(jī)制的共同作用下調(diào)控其增殖、凋亡、分化及血管重塑等功能，以確保胚胎的正常發(fā)育。滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙將導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，如流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)等?；袅鳟a(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊類型，其發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。PSMB8是在稽留流產(chǎn)絨毛組織的蛋白質(zhì)組學(xué)譜系中被鑒定到差異蛋白之一，與絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的功能關(guān)系密切，但其功能尚不明確。本研究以HTR-8為研究對(duì)象，旨在研究PSMB8對(duì)HTR-8細(xì)胞凋亡及自噬的影響，了解PSMB8在HTR-8細(xì)胞凋亡及自噬過程中產(chǎn)生的作用。

PSMB8作為免疫型蛋白酶體的關(guān)鍵亞基，已被證實(shí)具有影響細(xì)胞凋亡的能力。比如，PSMB8通過介導(dǎo)ERK1/2和PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡、遷移和侵襲，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中加入PSMB8靶向抑制劑后導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，凋亡增加[14，15]。本研究在HTR-8細(xì)胞中沉默PSMB8基因后，CCK8、流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL檢測(cè)法的結(jié)果一致表明HTR-8細(xì)胞凋亡水平明顯增高，說明PSMB8對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡功能產(chǎn)生了影響。半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族是直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡分解的蛋白酶系統(tǒng)，其中caspase-3參與了兩條觸發(fā)凋亡的主要通路，分別是細(xì)胞膜死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)重要地位[16]。正常情況下，caspase-3以無活性的酶原狀態(tài)存在，在相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間進(jìn)行剪切后產(chǎn)生有活性的caspase-3(cleaved)，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。免疫熒光結(jié)果顯示，敲減PSMB8后caspase-3(cleaved)蛋白比率明顯上升，表明PSMB8 siRNA可能是通過激活細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵調(diào)控蛋白caspase-3，引發(fā)多種凋亡途徑，從而誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。

自噬-溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway，ALP)是不同于凋亡的一種程序性死亡方式。它是指胞質(zhì)內(nèi)雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹內(nèi)容物的過程，需要Atg家族及多種蛋白因子的參與[17]。Agt1(ULK1)、Agt14參與了自噬體的形成，Atg5-Atg12復(fù)合物和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule- associated protein1 light chain 3，LC3)對(duì)于自噬體的延伸和成熟極為重要。LC3包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后LC3Ⅰ在Atg3、Atg7等因子的作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ與自噬體膜結(jié)合[18]。本研究中，PSMB8表達(dá)下降后，免疫熒光檢測(cè)自噬標(biāo)志LC3陽性率明顯增高并且自噬相關(guān)基因ULK1、Agt14、Atg5、Atg12、Atg3、Atg7 mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，提示PSMB8 siRNA通過誘導(dǎo)自噬體形成和延伸階段來增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平。

研究顯示自噬與凋亡的關(guān)系十分復(fù)雜，一方面自噬可以通過降解促凋亡蛋白來抑制細(xì)胞凋亡[19]；另一方面，當(dāng)細(xì)胞自噬過度激活后將會(huì)活化線粒體中的前凋亡因子來誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[20]。因此，除了PSMB8表達(dá)下調(diào)對(duì)HTR-8細(xì)胞凋亡的直接誘導(dǎo)作用之外，沉默PSMB8后細(xì)胞內(nèi)高水平的自噬也可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解主要通過兩種途徑，包括ALP和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)。UPP是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的依賴ATP 的非溶酶體降解途徑，能夠快速地降解一些錯(cuò)誤折疊的和短暫控制基本細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)蛋白，來維持細(xì)胞的正常生物學(xué)功能[21]。越來越多的證據(jù)表明ALP和UPP相互影響，當(dāng)UPP功能受損時(shí)，未折疊的蛋白質(zhì)積累，從而誘導(dǎo)自噬水平代償性增高。在經(jīng)過乙醇處理后的大腦皮質(zhì)中，免疫蛋白酶體被誘導(dǎo)活化，標(biāo)準(zhǔn)型蛋白酶體亞基表達(dá)下降，大量泛素化的蛋白質(zhì)無法分解，同時(shí)導(dǎo)致ALP受到抑制并且自噬體的體積發(fā)生變化。因此，沉默PSMB8后導(dǎo)致蛋白酶體功能受損，誘導(dǎo)HTR-8細(xì)胞內(nèi)自噬水平補(bǔ)償性上升，可能是細(xì)胞內(nèi)自噬水平增強(qiáng)的機(jī)制，但是仍需要更深入的研究進(jìn)行解釋。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在HTR-8細(xì)胞內(nèi)下調(diào)PSMB8的表達(dá)可以誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡并且激活自噬，初步發(fā)現(xiàn)PSMB8參與稽留流產(chǎn)發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制提供新的思路。