邢 倩 鄭溜豐 甘 婷 肖 婷 鄧澤元 劉小如

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

由肥胖、糖尿病等導(dǎo)致的心血管疾病已成為全球死亡的首要原因[1]。根據(jù)《中國心血管病報(bào)告2018》指出，過去10年中國死于心血管疾病的居民占總構(gòu)成比的40%以上，居于首位，高于腫瘤及其他疾病[2]。雖然心血管疾病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但慢性低水平炎癥是包括心血管疾病在內(nèi)的多種慢性病發(fā)生發(fā)展的典型特征之一[3]。炎癥本身是人體重要的免疫性防御機(jī)能，但是長期過剩的慢性低水平炎癥會(huì)造成人體功能受損，最終直接導(dǎo)致慢性病的發(fā)生[4-5]。更有研究[6]指出，動(dòng)脈粥樣硬化最有潛質(zhì)的干預(yù)靶點(diǎn)是低水平炎癥。另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，其中炎癥是其重要誘因[7]。因此，通過抑制低水平炎癥導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是防治心血管疾病的重要手段[8]。

近年來發(fā)現(xiàn)，藥食兼用植物以安全、低耐藥、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢對(duì)于炎癥有良好的治療作用[9]。三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)是中國民間常用的中草藥，有藥食兩用功效，主要分布于江西、安徽、浙江及西南地區(qū)[10]，以安全無副作用、低耐藥性的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[11]。作為中草藥，三葉青具有祛風(fēng)化痰，清熱解毒等多種活性。三葉青臨床應(yīng)用歷史悠久，對(duì)于治療惡性腫瘤、炎癥反應(yīng)、抗病毒、保肝的效果尤為顯著[12-13]。三葉青的抗癌作用已被廣泛研究[14]，其可抑制癌細(xì)胞的生長與繁殖。Peng等[15]發(fā)現(xiàn)三葉青乙酸乙酯提取物可激活線粒體途徑，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡。試驗(yàn)主要探究三葉青的抗炎活性成分，為三葉青的藥用價(jià)值尋找新靶點(diǎn)。Liu等[16]報(bào)道了以10～160 μg/mL的三葉青根部黃酮粗提物處理細(xì)胞，可以顯著降低一氧化氮、IL-1β、TNFα等促炎因子的產(chǎn)生，抑制NF-κB通路活性，并上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，從而緩解炎癥反應(yīng)。這些提示除抗癌外，三葉青有望成為安全有效的藥食兩用抗炎中草藥。此外，課題組[17]從三葉青的根部和葉片中鑒定出了133種天然產(chǎn)物，其中根部中山奈酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮素含量較多；而葉片中富含的成分有5-咖啡?？鼘幩帷⑷嚥蒈?、異牡荊苷、異葒草苷、牡荊苷，但具體何種成分發(fā)揮抗炎作用及其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor NF-E2 related factor，Nrf2)是被廣泛關(guān)注的藥效靶標(biāo)，參與對(duì)慢性病下細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，激活Nrf2可成為防治心血管疾病的有效方法[18-19]。最新的研究指出，Nrf2是抗炎網(wǎng)路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[20]，在正常條件下，Nrf2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，與泛素連接酶肌動(dòng)結(jié)合蛋白Keap1結(jié)合并促進(jìn)自身泛素化及降解[21]。值得注意的是，與Keap1的結(jié)合是植物活性物質(zhì)促使Nrf2解離并入核發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[22]。

試驗(yàn)擬基于與Keap1蛋白的分子對(duì)接，從三葉青中篩選了可能具有潛在抗炎活性的成分，同時(shí)在腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)聯(lián)合白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平炎癥模型下深入探究具體何種活性成分能強(qiáng)效抗炎，并分析該活性成分在培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性及細(xì)胞中的攝取，同時(shí)揭示其抗炎機(jī)制，旨在為三葉青發(fā)揮強(qiáng)效抗炎作用提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial，HUVEC)：武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑

細(xì)胞因子IL-17、腫瘤壞死因子TNFα：美國Peprotech公司；

Ham's F-12K (Kaighn's) Medium(F-12K)培養(yǎng)基：武漢普諾賽生命科技有限公司；

胎牛血清(FBS)：以色列Biolnd公司；

胰蛋白酶：美國Sigma公司；

山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡酰奎寧酸(新綠原酸)、牡荊苷、葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品：>98%，中國索萊寶科技有限公司；

Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、BCA蛋白濃度測定試劑盒：中國碧云天生物科技公司；

RIPA裂解液：加拿大Thermo Fisher公司；

一抗：英國Abcam公司；

二抗：北京全式金生物有限公司；

TRIzolTMReagent：加拿大Thermo Fisher公司；

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)：日本TaKaRa公司；

Bestar?qPCR mastermix(SYBR Green)：德國DBI?Bioscience公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：1290型，美國Agilent公司；

三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀：6470型，美國Agilent公司；

生物安全柜：BHC-1300A/B3型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

低溫高速離心機(jī)：Neofuge 15R型，香港力康公司；

細(xì)胞破碎儀：Qsonica Sonicator Q500型，加拿大Thermo Fisher 公司；

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：Forma series II型，加拿大Thermo Fisher公司；

化學(xué)發(fā)光成像儀：ChemiDocTMXRS+型，美國伯樂公司；

蛋白質(zhì)電泳儀：DYCZ-24DN型，北京六一生物科技有限公司；

轉(zhuǎn)膜儀：Criterion系，美國伯樂公司；

倒置顯微鏡：37XC(XDS-1A)型，上海蔡康光儀器公司；

震蕩混合器：WH-866型，中國太倉科教器材廠；

實(shí)時(shí)定量PCR：CFX96 Touch型，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 Keap1蛋白的同源建模和分子對(duì)接 采用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL預(yù)測人源Keap1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，選擇相似度且評(píng)分最高的模型作為蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)[23]。采用Ramachandran plot和Profile-3D方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步采用分子對(duì)接軟件AutoDockTools將Keap1與成分進(jìn)行對(duì)接，使用Flexible Docking模塊計(jì)算兩者相互作用的位點(diǎn)及對(duì)接能。成分的分子結(jié)構(gòu)從Automated Topology Builder上下載。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)及0.1%雙抗的F-12K培養(yǎng)基中。待細(xì)胞長滿后棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，加入含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察到游離細(xì)胞后棄去消化液，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打，稀釋后裝入新培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot測定細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 將山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷、葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品分別用二甲基亞砜溶解，配成200 mmol/L的母液，用培養(yǎng)基稀釋至試驗(yàn)需求濃度。將HUVEC細(xì)胞用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)基稀釋。取6 cm小皿，每皿加入3 mL細(xì)胞，放進(jìn)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h至貼壁。倒掉培養(yǎng)基，每皿加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品孵育2 h，再用1 ng/mL TNFα聯(lián)合100 ng/mL IL-17誘導(dǎo)細(xì)胞低水平炎癥，37 ℃培養(yǎng)12 h。結(jié)束后參考Zheng等[24]的方法制備細(xì)胞全蛋白裂解液，BCA法測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，最終發(fā)光顯影拍照，導(dǎo)入軟件分析得到蛋白表達(dá)量。

1.2.4 CCK8方法測定細(xì)胞存活率 96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁。在進(jìn)行牡荊苷自身的細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)加入不同濃度的牡荊苷，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。在進(jìn)行牡荊苷緩解內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的試驗(yàn)時(shí)先加入不同濃度的牡荊苷孵育2 h，再用1 ng/mL TNFα聯(lián)合100 ng/mL IL-17誘導(dǎo)細(xì)胞低水平炎癥，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后倒掉培養(yǎng)基，加入CCK8，1 h后用酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。按式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(1)

式中：

c——細(xì)胞存活率，%；

OD1——試驗(yàn)組OD450 nm值；

OD2——對(duì)照組OD450 nm值。

1.2.5 熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種到24孔板中，貼壁后加入不同濃度牡荊苷培養(yǎng)24 h。使用Trizol試劑提取法[24]提取細(xì)胞中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作得到所需cDNA，取2 μL進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：Nrf2，上游5'-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3'，下游5'-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3'；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，上游5'-GCATCCAGCTACGAATCTCC-3'，下游5'-GAACCAGCATCTTCCTCAGC-3'；細(xì)胞間黏附分子(ICAM)，上游5'-GGAAATACTGAAACTTGCTGCCTAT-3'，下游5'-ACACATGTCTATGGAGGGCCAC-3'；β-actin，上游5'-CCTGACTGACTACCTCATGAAG-3'，下游5'-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA-3'。配置好反應(yīng)混合液，加入96孔反應(yīng)板中，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 藥物穩(wěn)定性的測定 用F-12K培養(yǎng)基或Hank's平衡鹽溶液(HBSS)稀釋牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品至60 μmol/L。放入37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0.0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，12.0 h后取出，過0.22 μm的濾膜，利用超液相色譜檢測牡荊苷的含量。

液相條件：色譜柱型號(hào)為Zorbax Eclipse Plus C18(5 μm，3.0 mm×100 mm)；流動(dòng)相0.1% 甲酸—乙腈(A)和0.1% 甲酸—水(B)。梯度洗脫條件為：0～2 min，20%～25% A；2～7 min，25%～30% A；7～8 min，30%～20% A。流速0.3 mL/min，色譜柱溫度25 ℃，參比波長280 nm，收集波長340 nm，進(jìn)樣量10 μL。

以0 h培養(yǎng)基中牡荊苷的含量作為100%，將不同處理時(shí)間下牡荊苷的含量與0 h的含量對(duì)比分析，得到牡荊苷隨時(shí)間變化在培養(yǎng)基中殘留的百分率。

1.2.7 細(xì)胞吸收的測定 HUVEC細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后加入不同濃度牡荊苷培養(yǎng)2 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌兩遍，加入1.5 mL PBS收集細(xì)胞至離心管中，取1/10測蛋白濃度，剩下的部分2 000 r/min離心5 min。棄上清，5%甲酸—甲醇復(fù)溶，冰水浴超聲處理5 min使細(xì)胞破碎，結(jié)束后放入-80 ℃冰箱過夜。第2天取出室溫溶解，渦旋2 min，2 000 r/min離心10 min，收集上清。再用1 mL 5%甲酸—甲醇重復(fù)提取兩次。上清液合并，氮吹后用250 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測分析細(xì)胞中牡荊苷的含量。

質(zhì)譜條件：采用三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，裝備電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子+MRM模式定量分析。牡荊苷的定量條件為：母離子m/z431.1，子離子m/z311.1，裂解電壓160 V，碰撞能18 eV；進(jìn)樣量5 μL[25]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 每個(gè)樣品指標(biāo)測定3次，以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)形式表示。以SPSS軟件中的單因素方差分析處理，Duncan比較進(jìn)行顯著性分析，P<0.05(*)、P<0.01(**)、P<0.001(***)表示與未處理的對(duì)照組有顯著性差異。P<0.05(#)、P<0.01(##)、P<0.001(###)表示與1 ng/mL TNFα聯(lián)合100 ng/mL IL-17誘導(dǎo)的低水平炎癥組有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青中6種候選成分與Keap1蛋白的分子對(duì)接

分子對(duì)接是一種在分子層面預(yù)測配體和受體之間結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。試驗(yàn)采用分子對(duì)接方法初步對(duì)比分析了三葉青根部和葉片中幾十種含量豐富的成分與Keap1蛋白的結(jié)合能力，篩選出了6種成分可與Keap1蛋白顯著結(jié)合，分別是山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷。由圖1可知，這6種成分均結(jié)合在Keap1蛋白分子的活性空腔之中，并且主要的結(jié)合位點(diǎn)是纈氨酸殘基。該活性空腔恰恰是Keap1與Nrf2結(jié)合的區(qū)域，提示這6種成分與Keap1的結(jié)合很可能阻斷了Keap1與Nrf2的相互作用，進(jìn)而使Nrf2解離活化。另外，白藜蘆醇具有良好的抗炎活性，通常作為陽性對(duì)照，圖1中顯示山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷6種成分的對(duì)接能均小于白藜蘆醇的，證明與Keap1蛋白的結(jié)合能力均強(qiáng)于白藜蘆醇；其中最強(qiáng)的是山柰酚-3-O-蕓香糖苷，其次是牡荊苷。以上提示，三葉青中的這6種成分可能均具有良好的抗炎效果。

圖1 三葉青中6種候選成分與Keap1蛋白的分子對(duì)接

Figure 1 Molecular docking betweensix candidate ingredients inTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg and Keap1 protein

2.2 三葉青中6種候選成分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的抑制作用

研究使用濃度為100 μmol/L或50 μmol/L的成分處理細(xì)胞，聯(lián)合低劑量TNFα與IL-17誘導(dǎo)低水平血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，采用Western blot法檢測山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷6種成分對(duì)促炎因子和黏附分子表達(dá)的影響。如圖2所示，聯(lián)合低劑量TNFα與IL-17可升高各類炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)，6種成分可不同程度的下調(diào)炎癥因子表達(dá)量。當(dāng)濃度為100 μmol/L時(shí)，異槲皮苷、蘆丁、葒草苷、牡荊苷對(duì)于ICAM的抑制作用更為顯著，而牡荊苷可更加顯著地抑制血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)的表達(dá)。當(dāng)濃度為50 μmol/L時(shí)，牡荊苷更明顯地下調(diào)了白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的蛋白表達(dá)。綜上所述，牡荊苷的抗炎效果最明顯。

2.3 牡荊苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

CCK8試驗(yàn)測定了牡荊苷對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用以及在血管內(nèi)皮細(xì)胞中牡荊苷對(duì)低劑量TNFα與IL-17誘導(dǎo)低水平炎癥的緩解作用，結(jié)果見圖3。圖3(a)為牡荊苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，與未處理的空白對(duì)照組細(xì)胞相比，牡荊苷濃度<80 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性沒有影響，高于80 μmol/L后對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)明顯的抑制生長作用。因此，選用20，40，60 μmol/L作為試驗(yàn)組濃度。圖3(b)顯示，與對(duì)照組相比，聯(lián)合低劑量TNFα和IL-17降低細(xì)胞存活率，但以20，40，60 μmol/L牡荊苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵2 h后，細(xì)胞存活率呈濃度依賴性的升高，證明牡荊苷對(duì)低劑量TNFα與IL-17誘導(dǎo)的低水平炎癥具有緩解作用。

圖2 三葉青中6種候選成分的抗炎活性

圖3 牡荊苷對(duì)HUVEC細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

2.4 牡荊苷激活Nrf2信號(hào)通路

從Nrf2-Keap1復(fù)合物上解離的Nrf2能在細(xì)胞內(nèi)富集并活化，為了在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果，即牡荊苷與Keap1的結(jié)合可活化Nrf2，試驗(yàn)檢測了牡荊苷處理細(xì)胞后Nrf2信號(hào)通路活性。圖4(a)～(c)顯示，20～60 μmol/L牡荊苷以濃度依賴方式顯著增加Nrf2的基因和蛋白表達(dá)水平，相反降低Keap1蛋白的表達(dá)水平，故而Nrf2/Keap1比值會(huì)逐漸升高[見圖4(d)]，表明Nrf2通路被激活。

2.5 牡荊苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)

為檢測牡荊苷對(duì)HUVEC細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響，采用熒光定量PCR法檢測了20，40，60 μmol/L牡荊苷調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的作用，結(jié)果見圖5。20，40，60 μmol/L牡荊苷均可下調(diào)促炎因子IL-1β和黏附分子ICAM的基因表達(dá)，隨著牡荊苷濃度的加大基因表達(dá)量下降，證明牡荊苷可緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。因此，牡荊苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中低劑量TNFα與IL-17誘導(dǎo)低水平炎癥有抑制作用。

圖4 牡荊苷激活Nrf2信號(hào)通路

圖5 牡荊苷抑制HUVEC細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)

2.6 牡荊苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

采用Western blot方法研究了20，40，60 μmol/L牡荊苷對(duì)HUVEC細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞發(fā)生炎癥之后，引起炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)升高，由基因進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)，炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)如圖6所示。20，40，60 μmol/L牡荊苷可逐漸下調(diào)炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)，其中促炎因子IL-6表達(dá)水平與低水平炎癥組比有顯著性下降，IL-1β無顯著差異。證明牡荊苷可抑制促炎因子的蛋白表達(dá)，其結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致，更好地說明了牡荊苷具有良好的抗炎效果。Lu等[26]證明在C57BL/6小鼠中，牡荊苷抑制脂多糖引起的TNFα、IL-6以及IL-1β表達(dá)增加，發(fā)揮抗炎作用。

2.7 牡荊苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的活性

核因子-κB(NF-κB)調(diào)控著細(xì)胞的炎癥水平，抑制NF-κB信號(hào)通路可以阻止產(chǎn)生過多的炎癥介質(zhì)。利用Western blot法檢測了牡荊苷對(duì)NF-κB p65蛋白磷酸化的影響，結(jié)果如圖7所示。20，40，60 μmol/L牡荊苷可以逐漸降低磷酸化p65蛋白水平，呈劑量依賴關(guān)系。證明了牡荊苷可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，從而進(jìn)一步降低促炎因子的基因和蛋白表達(dá)。

圖6 牡荊苷抑制HUVEC細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

圖7 牡荊苷對(duì)NF-κB p65蛋白磷酸化的影響

2.8 牡荊苷在細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性

藥物的作用與其在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性有緊密聯(lián)系，經(jīng)不同時(shí)間處理后，牡荊苷在HBSS及F-12K培養(yǎng)基中殘留的液相圖及計(jì)算結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，牡荊苷在F-12K細(xì)胞培養(yǎng)基及HBSS緩沖液中均表現(xiàn)為很強(qiáng)的穩(wěn)定性，尤其是12 h后在F-12K細(xì)胞培養(yǎng)基中的保留率達(dá)80%以上。牡荊苷的強(qiáng)穩(wěn)定性源于自身結(jié)構(gòu)中存在8號(hào)位點(diǎn)糖基化[27]，而在培養(yǎng)基中穩(wěn)定性更高可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)基中含有血清蛋白。Tang等[28]報(bào)道，多酚化合物可以與蛋白質(zhì)相互作用，使得多酚的穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.9 牡荊苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的攝取

研究[27]表明，藥物的抗炎效果與其細(xì)胞內(nèi)的吸收有關(guān)。試驗(yàn)利用了液相三重串聯(lián)四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-QqQ-MS)檢測了20，40，60 μmol/L牡荊苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的含量。由圖9可知，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以原型形式攝取牡荊苷，且隨著牡荊苷的濃度增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)牡荊苷的攝取程度加大，在細(xì)胞內(nèi)的牡荊苷含量增多。特別是以60 μmol/L牡荊苷刺激細(xì)胞之后，牡荊苷在細(xì)胞內(nèi)的含量達(dá)到了(3.03±0.79) pmol/mg·蛋白。說明吸收的牡荊苷含量增多，所以逐漸下調(diào)了各類炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，增加了抗炎效果。

圖8 牡荊苷在細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性

圖9 牡荊苷在HUVEC細(xì)胞中的含量

3 結(jié)論

三葉青中山柰酚-3-O-蕓香糖苷等6種候選成分均具有抗炎活性，其中活性最強(qiáng)的是牡荊苷。牡荊苷主要富含于山楂、牡荊草等植物中，且在三葉青中含量也達(dá)到了(8.28±2.03) mg/g干物質(zhì)[17]。目前牡荊苷主要用于治療心血管疾病，并且還能發(fā)揮明顯的防癌抗腫瘤作用[29]。研究通過血管內(nèi)皮細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)了牡荊苷的抗炎效果，這也許解釋了其為何能降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。

Nrf2是在抗炎反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的新機(jī)制，其活化機(jī)理主要包括兩個(gè)方面：① 親電子化合物以共價(jià)鍵的方式與Keap1蛋白的半胱氨酸殘基結(jié)合，使Keap1蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)變得松散，促進(jìn)Nrf2從Nrf2-Keap1復(fù)合物上解離[22]。Mills等[20]報(bào)道衣康酸通過烷化Keap1蛋白上的半胱氨酸殘基使得Nrf2解離活化。② 小分子化合物以非共價(jià)鍵的方式與Keap1蛋白結(jié)合，通過占據(jù)Nrf2與Keap1蛋白結(jié)合的活性空腔使Nrf2解離活化[22]。研究篩選出的牡荊苷等小分子植物化學(xué)物正是結(jié)合在Keap1蛋白的活性空腔中，促使Nrf2活化。

牡荊苷能夠激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平炎癥，有望成為防治慢性炎癥乃至慢性疾病的新契機(jī)。試驗(yàn)還有待進(jìn)一步完善與探索。