李垚熹 袁艷秋 巨 倩 高夢楠 周樹義 胡亞云 欒廣忠

(西北農(nóng)林科技大學食品學院，陜西 楊凌 712100)

大豆貯藏蛋白的主要成分為β-Conglycinin(7S大豆球蛋白)，是一種由α′、α、β3種不同亞基構(gòu)成的三聚體[1-2]，占大豆蛋白的30%，其對大豆蛋白的結(jié)構(gòu)功能特性影響顯著。研究[3-5]表明，α′及α亞基的結(jié)構(gòu)可分為核心區(qū)(core region)和延展區(qū)(extension region)，且均含有兩個N-連接糖基；β-亞基則不具備延展區(qū)，只有一個N-連接糖基。Maruyama等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，在N-連接糖基及延展區(qū)缺失后，原核宿主的核心區(qū)仍能自組裝成三聚體。阻礙7S大豆球蛋白凝集的原因可能在于其糖基具有較強的親水性[8-9]，因此提高7S大豆球蛋白的凝膠能力的關(guān)鍵或許在于去除糖基。目前，重組蛋白純化領(lǐng)域中起重要作用的是親和標簽，其中最普遍使用的是His標簽。許妍妍等[10-11]采用基因克隆技術(shù)、基因重組技術(shù)以及蛋白分離純化技術(shù)成功制備了缺失N-連接糖基的重組α’-亞基。試驗擬選取品種為齊黃34的大豆種子提取大豆總RNA，使用大腸桿菌作為原核宿主對β-伴大豆球蛋白的α-亞基核心區(qū)進行克隆與表達，并利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)通過鎳離子親和層析柱對其進一步純化，為后期重組大豆蛋白分散體系的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、載體與菌種

大豆：齊黃34，山東省農(nóng)科院；

感受態(tài)細胞E.coliDH 5α、E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28a：西安熱默爾生物科技有限公司；

質(zhì)粒pGEM-T Easy：普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)分子量 Marker(3597Q)、rTaq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、Quick Cut限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ：寶生物工程(大連)有限公司；

T4-DNA連接酶：普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；

瓊脂粉、β-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)：北京索萊寶有限公司；

其余試劑為國產(chǎn)分析純；

PCR擴增儀：Hema 9700型，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；

超微量紫外—可見分光光度計：NanoPro 2010型，北京鼎昊源科技有限公司；

冷凍離心機：Neofuge 15R型，上海力申科學儀器有限公司；

通風櫥：CAV1000型，肯尼亞F&S Scientific公司；

超聲波細胞破碎儀：VC130型，美國 Sonics & Materials公司；

蛋白純化系統(tǒng)：ClearFirst-3000型，上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物的設計與合成 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找7S大豆球蛋白α-亞基的基因序列，GB編號為NM_001249927.2(Glycine max beta-conglycinin alpha-subunit 〔CG-3〕, mRNA)，依據(jù)編碼核心區(qū)的基因序列設計一對特異性引物，即上游引物F1：5′-CCGACGACGACGACAAGGATTCTGAGTTACGAAGA-3′，下游引物R1：5′-CCGCTCGAGTTCAGTAAAAAGCCC-3′?？紤]到蛋白純化后N-端標簽的處理，設計上游引物時引入了腸激酶酶切位點(加粗部分)及其保護堿基；為方便后續(xù)克隆，在下游引物中引入了內(nèi)切酶Xho Ⅰ酶切位點(加粗部分)、終止密碼子(斜體部分)及相應的保護堿基，理論上擴增所得的基因片段大小為1 300 bp左右，引物合成由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.3.2 目的基因的擴增 將齊黃34大豆種子使用液氮研磨成粉末，取300 mg凍干粉提取總RNA，而后以此為模板運用試劑盒自帶的Random 6 mers構(gòu)建cDNA單鏈。具體操作步驟：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，70 ℃保溫15 min，4 ℃恒溫保存。以cDNA單鏈為模板利用自行設計的引物F1/R1對目的基因αc進行擴增，選用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳對目的基因進行檢測并回收，PCR反應體系參考Maruyama等[6]的方法修改如下：PrimeSTAR Max Premix(2×) 25 μL，F(xiàn)1(20 μmol/L) 0.5 μL，R1 (20 μmol/L) 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄反應液4 μL，無菌純水補加至50 μL。PCR反應條件為98 ℃變性10 s，66 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

1.3.3 重組克隆載體的構(gòu)建、篩選及鑒定 參照許妍妍等[10-11]的方法并修改。通過T4-DNA連接酶將目的基因片段αc與選用的克隆載體pGEM-T Easy相連接，將連接體系于16 ℃反應1 h，導入感受態(tài)細胞E.coliDH 5α中。在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中隨機挑取4～5個獨立的白色菌落用于菌落PCR篩選。菌落PCR反應體系：聚合酶rTaq mix 26 μL，單克隆菌株菌液2 μL，F(xiàn)1/M47 (20 μmol/L) 2 μL，F(xiàn)2/M48 (20 μmol/L) 2 μL，添加去離子水至50 μL。使用氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基對篩選出的陽性克隆菌株進行培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒，選用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳及XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切對所提質(zhì)粒進行鑒定。首先通過XhoⅠ內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒5 min，再加入EcoRⅠ內(nèi)切酶繼續(xù)酶切15 min。將鑒定結(jié)果與預期相符的質(zhì)粒進行外送測序(由西安熱默爾生物科技有限公司完成)，將測序結(jié)果與NCBI的α-亞基核心區(qū)的基因編碼區(qū)進行序列比對[12]，將測序符合預期的構(gòu)建成功的重組克隆載體命名為pGEM-αc，將陽性克隆菌株于37 ℃進行增菌培養(yǎng)后，于-80 ℃保存菌種。

1.3.4 重組表達載體的構(gòu)建、篩選及鑒定 使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ/EcoRⅠ對重組克隆載體pGEM-αc和選用的表達載體pET-28a進行雙酶切，酶切反應體系：待酶切載體10 μL，內(nèi)切酶XhoⅠ/EcoRⅠ各1 μL，10× Quick Cut Green Buffer緩沖液5 μL，添加去離子水至50 μL。將二者的雙酶切體系于37 ℃反應15 min后回收產(chǎn)物，通過10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行鑒定并回收具有雙黏性末端的目的片段。

將上述兩種目的片段回收后，在T4-DNA連接酶作用下于16 ℃連接1 h，連接體系(20 μL)：pGEM-αc雙酶切產(chǎn)物5 μL，pET-28a雙酶切產(chǎn)物10 μL，50% PEG 2 μL，T4-DNA連接酶1 μL，T4-DNA連接酶10×Buffer 2 μL。將連接成功的產(chǎn)物導入到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，選用卡那霉素濃度為50 μg/mL的固體LB培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化菌液進行培養(yǎng)，同時設置陽性與空白對照，37 ℃培養(yǎng)14 h。隨機挑取若干獨立的單克隆菌落，利用特異性上游引物F1和通用下游引物T7er對其進行菌落PCR篩選。將篩選出的陽性菌株接種于卡那霉素濃度為50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒，使用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳及Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ單、雙內(nèi)切酶酶切對質(zhì)粒進行鑒定，將鑒定結(jié)果與預期相符的質(zhì)粒外送測序。以pET-28a-αc為測序結(jié)果正確的重組表達載體，以pET-28a-αc-BL21為陽性菌株，挑選單菌落的陽性菌株于37 ℃下進行增菌培養(yǎng)，菌種置于-80 ℃保存[13-14]。

1.3.5 重組蛋白的提取 將pET-28a-αc-BL21的菌液培養(yǎng)6 h，以體積分數(shù)為1%的接種量接種至含有卡那霉素50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液濃度OD600 nm值為0.8時，加入0.2 mmol/L的誘導劑IPTG進行誘導表達，于37 ℃持續(xù)培養(yǎng)9 h，取1 mL誘導菌液用于SDS-PAGE電泳檢測(分離膠體積分數(shù)12%，濃縮膠體積分數(shù)5%)，通過Quantity One軟件分析目的蛋白表達量[15-17]。其余菌液于4 ℃，5 000 r/min離心15 min，收集菌體，使用磷酸鹽緩沖液PBS (25 mmol/L磷酸鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.02% NaN3，pH 7.4)對菌體重懸后通過冰浴超聲破碎菌體[8]，超聲條件：振幅25，6 s/4 s，30 min。超聲4～5個循環(huán)后取出，取1 mL全菌液用于后續(xù)SDS-PAGE分析，其余破碎菌體于4 ℃，8 500 r/min離心45 min，收集上清液即為目的蛋白α-亞基核心區(qū)的粗蛋白液，于4 ℃保存，將收集的全菌液、上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析[18-19]。

1.3.6 重組蛋白α-亞基核心區(qū)的純化 使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對重組α-亞基核心區(qū)的粗蛋白液進行純化，將制備好的100 mL粗蛋白溶液通過孔徑為0.45 μm的水性濾膜過濾后，于4 ℃儲藏，使用自動上樣泵上樣到預先用磷酸鹽緩沖液平衡好的His Trap HP預裝柱上，先使用5～10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液洗脫未與鎳離子柱結(jié)合的雜蛋白，于280 nm下檢測并收集各蛋白峰直至峰值達到基線，使用20%，50%，80%，100%的含有500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液對樣品進行洗脫并收集對應的蛋白峰。將收集到的所有蛋白峰通過SDS-PAGE電泳進行分析鑒定[20-22]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 使用NCBI官網(wǎng)的Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能對測序結(jié)果進行對比分析；使用UniProt官網(wǎng)(http://www.uniprot.org/blast/)查找7S大豆球蛋白α-亞基核心區(qū)的氨基酸序列并使用Blast功能進行比對；使用DNA MAN軟件分析重組表達載體的堿基序列及編碼氨基酸；使用軟件Snap Gene分析重組表達載體的測序結(jié)果；使用軟件Quntity One分析目的蛋白α-亞基核心區(qū)的表達量；使用Image Lab分析核酸電泳凝膠圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆總RNA的提取

由圖1可知，1、3泳道的兩個條帶較為清晰，分別為28S和18S，證明提取的RNA并未被大量降解；而2、4泳道中的兩個條帶稍顯模糊，尤其是2泳道中的條帶彌散比較明顯，說明所提取的RNA可能存在大部分被降解的情況，因此使用超微量紫外—可見光分光光度計進行進一步測定。1～4泳道的RNA樣品濃度分別為96.65，35.22，85.94，53.95 ng/μL，各樣品的A260 nm/A280 nm分別為2.04，1.75，1.97，1.95。綜上，2、4泳道中提取的RNA樣品質(zhì)量不高，因此選取1、3泳道提取的大豆總RNA用于后續(xù)的RT-PCR試驗。

2.2 目的基因的擴增

由圖2可知，所得基因片段位置為1 000～1 500 bp，長度約為1 300 bp，與α-亞基核心區(qū)基因的理論值(1 265 bp)一致，證明α-亞基核心區(qū)基因片段擴增成功。

M. DL 5000 DNA Maker 1～4. 大豆總RNA

M. DL 5000 DNA Maker 1. α-亞基核心區(qū)基因片段

Figure 2 Amplification of target geneα-subunit core region by RT-PCR

2.3 重組克隆載體的構(gòu)建、篩選及鑒定

由圖3可知，采用自行設計的特異性引物F1/R1對隨機選取的5個菌株擴增得到的片段長度均為1 300 bp左右，與目的基因的理論值相一致；而使用通用引物M47/M48擴增得到的片段長度為2 000 bp左右，是因為特異性引物與通用引物的位點中間有一定的片段大小，因此該結(jié)果也與理論值相符。理論上而言，重組克隆載體經(jīng)單酶切后應形成清晰而單一的條帶，但pGEM-αc經(jīng)EcoRⅠ單酶切后形成兩個清晰條帶，其大小分別與克隆載體和目的基因的理論值相符，是因為選用的克隆載體pGEM-T Easy上帶有EcoRⅠ酶切位點；重組克隆載體經(jīng)Xho Ⅰ單酶切后能形成單一條帶，證實重組克隆載體構(gòu)建成功；而經(jīng)雙酶切后重組克隆載體被切成兩個較為清晰的條帶，且大小分別為3 000 bp與1 300 bp左右，與載體pGEM-T Easy(3 015 bp)和目的基因α-亞基核心區(qū)的理論值(1 265 bp)相符。

圖3 重組克隆載體pGEM-αc的鑒定及篩選

Figure 3 Identification and screening of recombinant cloning vector pGEM-αc

2.4 重組表達載體的構(gòu)建、篩選及鑒定

由圖4可知，4、5、6、12泳道擴增所得產(chǎn)物條帶大小為1 000～2 000 bp，約為1 300 bp，與目的基因理論長度相符，而其余泳道未出現(xiàn)目的條帶，可能是因為挑選的菌落為假陽性。考慮到條帶的清晰度、彌散程度和亮度，選用4、12泳道進行后續(xù)試驗。pET-28a-αc被限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ分別單酶切后均可得到與理論值大小相符的單一條帶；而被限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切后則得到兩個條帶，片段大小分別為1 300，5 000 bp左右，與α-亞基核心區(qū)(1 265 bp)和載體pET-28a(5 369 bp)的大小相符。通過測序比對可知，該序列與UniProt中編號為P0DO15的氨基酸序列相似度達到100%，未出現(xiàn)堿基移碼和錯配的現(xiàn)象，證明重組表達載體構(gòu)建成功。

2.5 重組蛋白的存在形式

由圖5可知，未添加誘導劑的工程菌pET-28a-αc-BL21經(jīng)超聲破碎后，其全菌液、上清液和沉淀中(1～3泳道)均未在50 kU附近出現(xiàn)目的蛋白條帶；而37 ℃下誘導培養(yǎng)的菌體經(jīng)超聲后的全菌液、上清液和沉淀中(4～6泳道)均于50 kU處出現(xiàn)目的蛋白條帶，由于上清液中所含的重組蛋白未形成包涵體，具有較好的溶解性，可收集用于進一步的分離純化[13,23]；蛋白純化的穿透峰及洗脫峰濃縮后的濾液(8泳道)、誘導培養(yǎng)的菌體超聲后的上清液經(jīng)蛋白純化的穿透峰及其濃縮液(9～10泳道)中無目的蛋白條帶，與期望相符的，證明在使用低濃度咪唑洗脫雜蛋白時并沒有目的蛋白被洗脫下來；而添加誘導劑的菌體超聲后的上清液經(jīng)蛋白純化的洗脫峰及其濃縮液(11～14泳道)中有目的蛋白的單一條帶，證明洗脫峰中目的蛋白含量較高，且目的蛋白含量為80%左右。

圖4 重組表達載體pGEM-28a-αc的鑒定及篩選

Figure 4 Identification and screening of recombinant cloning vector pGEM-28a-αc

M. 蛋白質(zhì)Marker 1～3. 未誘導工程菌的全菌、上清液和沉淀4～6. 誘導的全菌、上清液和沉淀 7. 天然7S 8. 蛋白純化峰濃縮后的濾液 9～10. 蛋白純化的穿透峰及濃縮液 11、13. 蛋白純化洗脫峰 12、14. 蛋白純化洗脫峰的濃縮液

圖5 重組α-亞基核心區(qū)的提取及純化電泳圖

Figure 5 Electrophoresis of the extraction and purification of the recombinantα-subunit core region

3 結(jié)論

從齊黃34品種的大豆種子中提取總RNA，通過自行設計的特異性引物F1/R1經(jīng)RT-PCR對7S大豆球蛋白α-亞基核心區(qū)的基因進行擴增，成功構(gòu)建了經(jīng)Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定、菌落PCR鑒定以及堿基測序均正確重組克隆載體pGEM-αc和重組表達載體pET-28a-αc。將重組表達載體pET-28a-αc導入到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達獲得分子量約為50 kU的重組α-亞基核心區(qū)蛋白，其表達條件為：OD600 nm值為0.8、IPTG濃度為0.2 mmol/L、誘導溫度為37 ℃、誘導時間為9 h，此條件下重組α-亞基核心區(qū)蛋白可以得到大量表達，其純度為87%以上。如何提高α-亞基核心區(qū)蛋白制備效率及純度還需進一步研究。