田紅雨，史曉夢，張 敏，王亞聰，張書蔚，冉隆賢

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000）

棗Ziziphus jujubaMill.屬于鼠李科棗屬植物，在我國最早栽培于7 000年前的黃河中下游地區(qū)，是我國最古老的果樹之一[1-2]。棗樹具有抗逆性強、經(jīng)濟效益和生態(tài)效益均顯著等特點，在我國的栽培十分廣泛，我國的棗樹栽培面積和棗果產(chǎn)量均占世界的98%以上[3-6]。棗果是一種藥食同源的果品，棗果含有多種氨基酸、維生素及豐富的礦質(zhì)元素，又有養(yǎng)血安神、補中益氣、強身健脾等功效，具有很高的營養(yǎng)與藥用保健價值[4-5,7-8]。

棗縮果病是棗樹生產(chǎn)中危害極為嚴重的病害之一，普遍發(fā)生于我國各主要產(chǎn)棗區(qū)，棗果受害后變色干縮，果肉呈海綿狀壞死，提前脫落，常導(dǎo)致大面積減產(chǎn)甚至絕收[9]。目前生產(chǎn)上對此病害的防治效果一直不夠理想，因為對其病原菌的侵入時間和侵入途徑等尚不明確。有關(guān)研究結(jié)果表明，棗縮果病菌在棗樹中具有長期潛伏侵染的特性[10]，不同地區(qū)的發(fā)病時期又存在差異性，侵染時間最早可發(fā)生于5月下旬，7—8月為發(fā)病初期，8月中下旬至9月上旬為發(fā)病高峰期[11-13]，病原菌主要從水孔、氣孔及果洼通過風雨傳播侵入棗果，也可從花、葉片侵入棗樹體內(nèi)[11,14]。有關(guān)研究者曾報道，棗縮果病的病原菌種類繁多，目前學(xué)術(shù)界對此仍存在很大的爭議。吳婷等[15]認為，真菌和細菌共同導(dǎo)致了棗縮果病的發(fā)生。韓黨悅[16]和許陽[17]都認為，棗縮果病的初侵染病原是互隔鏈格孢菌Alternaria alternata。這一研究結(jié)果解決了長期以來由于病原不清而導(dǎo)致的防治困難等問題，有助于扭轉(zhuǎn)40 多年來棗縮果病病原混雜不清的局面，為生產(chǎn)中棗縮果病的有效防治提供了技術(shù)支撐。何麗等[18]對新疆病果的病原菌進行常規(guī)分離后，選取了有代表性的菌株進行了致病性的檢測和鑒定，也明確了鏈格孢菌是棗縮果病的病原菌。

鏈格孢屬Alternaria真菌廣泛分布于世界各地，該屬真菌種類繁多，寄主范圍廣，適應(yīng)性強，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大約有500 種，可引起包括玉米、小麥、馬鈴薯、番茄和蘋果、梨等幾十種栽培植物的病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[19-20]。相關(guān)研究結(jié)果表明，蘋果斑點落葉病、梨黑斑病、馬鈴薯早疫病和番茄黑斑病的病原菌都是鏈格孢屬真菌[21-27]，蘋果、梨等果樹和馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物經(jīng)常栽培于棗園附近，但侵染這些植物的鏈格孢菌是否還可侵染棗樹，引起棗樹果實病害的發(fā)生，對此問題的研究尚未見諸報道。為此，本研究以蘋果斑點落葉病菌A.mali、梨黑斑病菌A.kikuchiana、馬鈴薯早疫病菌A.solani和番茄黑斑病菌A.alternata為研究對象，對其進行綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標記，并對成功標記的菌株在棗果上進行致病性檢測，以進一步探明棗縮果病初侵染鏈格孢菌的來源，并通過在棗樹花期噴霧接種GFP標記的4種鏈格孢菌，進一步探究其在棗樹上的侵染途徑，從而為更有效地防治棗縮果病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌和馬鈴薯早疫病菌（分別編號為ZN01、ZN02 與ZN03）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院曹克強教授和朱杰華教授提供；GFP 標記的互隔鏈格孢菌（編號為CN193）和番茄黑斑病菌（編號為ZNXR）、根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens gfp基因表達載體質(zhì)粒，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理研究室提供。

試劑和培養(yǎng)基：潮霉素B、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、鏈霉素的濃度分別為10、50、20、100、100 mg·mL-1，乙酰丁香酮（AS） 0.2 mg·mL-1；以IM 為培養(yǎng)基[28]，以LB 為液體培養(yǎng)基[29]。

供試植物：棗樹，栽培于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃。

1.2 方 法

1.2.1 4 種鏈格孢菌對潮霉素B 的敏感性的測定

采用生長速率法分別測定供試的4 種鏈格孢菌對潮霉素B 的敏感性。分別將ZN01、ZN02、ZN03 和ZN-XR 這4 種鏈格孢菌置于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，然后用直徑為 7 mm 的打孔器在所培養(yǎng)菌株的菌落邊緣打取菌碟，分別置于含有濃度依次為5、10、20、50 和100 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，以不加潮霉素B 培養(yǎng)的菌落作為對照，每個處理各設(shè)3 次重復(fù)。當對照菌落的直徑至少長到30 mm 時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算不同濃度潮霉素B 處理下4 種鏈格孢菌菌絲生長的抑制率[30]。將抑菌率（%）轉(zhuǎn)化為幾率值（y），將藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)（x），求出毒力回歸方程y=a+bx，根據(jù)此方程計算有效抑制濃度EC50值（μg·mL-1）及相關(guān)系數(shù)（r），并根據(jù)EC50值分析4 種鏈格孢菌對潮霉素B 的敏感性。

菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(處理菌落直徑)]×100%。

1.2.2 4 種鏈格孢菌的GFP 標記

取農(nóng)桿菌10 μg 加入到20 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（含 有20 μg·mL-1的利福平、50 μg·mL-1的卡那霉素和100 μg·mL-1的鏈霉素）中，在28 ℃、220 r·min-1的搖床中培養(yǎng)24 h 后取出，吸取1 mL轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管內(nèi)，以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，棄上清液，加入1 mL 的IM，吹打使其沉淀懸浮，再次以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 2 min，棄上清液后加入1 mL 的IM，再次吹打使其沉淀懸浮，然后轉(zhuǎn)移至9 mL 的IM 中，分別加入10 μL 的卡那霉素、鏈霉素、AS，置于搖床上，于28 ℃的溫度條件下以80 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 h后取出，加入無菌生理鹽水將光密度值（OD600）調(diào)節(jié)至0.2 ～0.3。將4 種鏈格孢菌的分生孢子懸浮液（1×106個·mL-1）置于4 ℃冰箱內(nèi)低溫處理 6 h，以提高轉(zhuǎn)化率，然后分別加入等體積的上述農(nóng)桿菌菌液混合，各取200 μL 均勻涂抹于劃線的無菌濾紙條上，再置于IM 固體培養(yǎng)基上，于 25 ℃的黑暗中培養(yǎng)36 h 后將濾紙條取出并翻轉(zhuǎn)置于含有5 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 GFP 標記菌株的穩(wěn)定性檢測

為了測定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，每種菌各隨機挑選8 個轉(zhuǎn)化子，將其接種到不加潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后，挑取新長出的菌絲將其轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。按上述方法繼代培養(yǎng)5 代，挑取4 種菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲，將其置于熒光顯微鏡下觀察并照相。為了測定其生長的穩(wěn)定性，將 4 種菌的第5 代轉(zhuǎn)化子和野生型菌株分別置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上在25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌落生長情況并測量其直徑。

1.2.4 GFP 標記的4 種鏈格孢菌侵染棗果的測定

將GFP 標記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌（編號為CN193::gfp）和空白的PDA培養(yǎng)基分別制備成4 mm×4 mm 的菌碟，采用刺傷接種的方法分別將其接種在健康的棗果上，每組各設(shè)8 個點，每個處理各設(shè)6 組，分別以接種CN193::gfp和空白PDA 作為對照。將接種后的棗果用保鮮膜包裹好，3 d 后取下保鮮膜，7 d 后觀察其發(fā)病情況并計算發(fā)病率，然后將發(fā)病棗果帶回實驗室，用70%的酒精消毒30 s，用無菌水沖洗3～ 4 次后取其病健交界處的組織，將其置于含有 10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，待其有菌絲長出后挑取各處理的菌絲，放在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

1.2.5 GFP 標記的4 種鏈格孢菌侵染棗花的測定

在棗樹花期于試驗地選擇未發(fā)生棗縮果病的棗樹，將GFP 標記的4 種鏈格孢菌和CN193::gfp分別置于PDA 培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后，用無菌水分別配制成濃度為105個·mL-1的分生孢子懸浮液以備用。以接種經(jīng)GFP 標記的 4 種鏈格孢菌為試驗組，以接種CN193::gfp為對照組，每組各選取3 株棗樹，每株棗樹各選2 個枝條，在無風雨的天氣且日照較弱的下午對棗花噴霧接種分生孢子懸浮液，每隔5 d 噴1 次，共噴3 次。待棗果長出并發(fā)病后采回，用70%的酒精消毒30 s， 用無菌水沖洗3 ～4 次后取病健交界處的組織，將其置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，待其有菌落長出后挑取菌絲，在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0 軟件用單因素方差分析法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，并用最小顯著差異法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種鏈格孢菌對潮霉素B 的敏感性

潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度EC50值見表1。蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對潮霉素B 的敏感程度有差別，但潮霉素B 的處理濃度與抑制效果間呈正相關(guān)，各處理的相關(guān)系數(shù)均在0.91 以上，說明這4 種鏈格孢菌對潮霉素B 均敏感，因此可使用以潮霉素B 標記的gfp基因?qū)@4 種鏈格孢菌進行標記。

2.2 GFP 標記菌株的穩(wěn)定性

分別挑取4 種鏈格孢菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲置于熒光顯微鏡400 倍下觀察，均可觀察到明顯的熒光，觀察結(jié)果如圖1 ～4 所示。從圖1 ～4中可以看出，第5 代與初代轉(zhuǎn)化子的熒光強度均無差異。培養(yǎng)5 d 后發(fā)現(xiàn)，4 種鏈格孢菌的第5 代轉(zhuǎn)化子在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均可正常生長，且其菌落直徑的大小與野生型菌株間均無差異。以上結(jié)果表明，經(jīng)GFP 標記的4 種鏈格孢菌其遺傳轉(zhuǎn)化后的特征明顯且穩(wěn)定。

表1 潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度Table 1 Virulence regression equations and median effective concentrations of hygromycin B

圖1 ZN01::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.1 Fluorescence comparison of hyphae from ZN01::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖2 ZN02::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.2 Fluorescence comparison of hyphae from ZN02::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖3 ZN03::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.3 Fluorescence comparison of hyphae from ZN03::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖4 ZN-XR::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.4 Fluorescence comparison of hyphae from ZN-XR::gfp in primary culture and the fifth subculture

2.3 GFP 標記的4 種鏈格孢菌對棗果的侵染

分別以GFP 標記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌（CN193::gfp）和空白的PDA 培養(yǎng)基對棗果進行刺傷接種后發(fā)現(xiàn)，接種CN193::gfp和4 種鏈格孢菌的棗果其后期均發(fā)病，接種CN193::gfp和ZN01、ZN02、ZN03、ZN-XR 的棗果其發(fā)病率分別為93.8%與75.0%、87.5%、81.3%、83.3%，且各處理間無顯著差異（P＞0.05），而空白對照的未發(fā)?。▓D5）。接種4 種鏈格孢菌的棗果均發(fā)病且均有病斑出現(xiàn)，其病斑均呈褐色凹陷狀，果肉呈土黃色、海綿狀壞死，提前脫落 （圖6 A—D），此癥狀與接種CN193::gfp的棗果的發(fā)病癥狀（圖6 E）相同。

圖5 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病率Fig.5 Disease incidences of jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

圖6 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病癥狀Fig.6 Symptoms of diseased jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

對刺傷接種CN193::gfp和4 種菌株后的發(fā)病棗果進行病組織分離，所有病組織在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均有菌落長出。分別挑取菌絲放在熒光顯微鏡（400 倍）下觀察，均可觀察到熒光，觀察結(jié)果如圖7 所示。這一觀察結(jié)果進一步表明，以蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌刺傷接種均可使棗果發(fā)病，供試菌株對棗樹均有致病性。

2.4 GFP 標記的4 種鏈格孢菌對棗花的侵染

將采回的花期噴霧處理枝條上的發(fā)病棗果置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)后，以4 種鏈格孢菌和CN193::gfp接種處理的病果上均有菌落長出，分別挑取各處理的菌絲放在熒光顯微鏡（400 倍）下觀察，均可觀察到熒光，觀察結(jié)果如圖8 所示。圖8 表明，蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均能通過棗花侵入棗樹。

圖7 以不同鏈格孢菌刺傷接種后從棗果病組織中分離出的菌絲Fig.7 Hyphae isolated from diseased tissues in jujube fruit inoculated with different Alternaria species through stabbing

圖8 從花期噴霧接種后的發(fā)病棗果中分離出的菌絲Fig.8 Hyphae isolated from diseased jujube fruits inoculated through spraying at florescence

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色熒光蛋白標記技術(shù)在許多重要的病原真菌侵染寄主過程中都得到了成功的應(yīng)用[31-37]。本研究采用張敏對棗縮果病菌（CN193）的GFP 標記方法[38]試驗發(fā)現(xiàn)，蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對潮霉素B 均敏感，因此，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，成功地將潮霉素B 標記的gfp基因轉(zhuǎn)入到了這4 種鏈格孢菌中，且轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性良好，可以有效避免田間分離回收病原菌時雜菌的干擾，并且與篩選抗藥性突變體的方法相比，在對病原菌的研究過程中具有更簡便、直觀、穩(wěn)定的特點，今后可利用此方法進一步研究棗縮果病菌的侵染規(guī)律和侵染動態(tài)。

本研究采用棗果刺傷接種的方法，檢測GFP標記的4 種鏈格孢菌對棗樹的致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均可使棗果產(chǎn)生與接種棗縮果互隔鏈格孢菌CN193::gfp相同的發(fā)病癥狀，從接種了4 種鏈格孢菌菌株的發(fā)病棗果中分離培養(yǎng)長出的菌絲，在熒光顯微鏡下均可觀察到熒光，說明蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均可使棗果發(fā)病，對棗樹均有致病性，這一研究結(jié)果與張敏等[39]對棗縮果病互隔鏈格孢菌潛在寄主的研究結(jié)果一致。因此，在棗園附近應(yīng)避免種植馬鈴薯、番茄、蘋果、梨及其它易被鏈格孢菌侵染的植物，應(yīng)做好周圍感病植物的病害管理和園區(qū)的綜合防治工作。今后還需進一步對其它鏈格孢屬真菌的致病性進行研究，分析其與棗縮果病互隔鏈格孢菌的同源性，從而為進一步明確棗縮果病的初侵染病原提供更加可靠的依據(jù)。

棗縮果病菌最初侵入棗樹的時期尚不明確，因此，本研究進一步探究了供試GFP 標記的4 種鏈格孢菌對棗樹的侵染途徑，將其在棗樹花期噴霧接種，待處理枝條上的棗果長出并發(fā)病后帶回實驗室分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其病組織分離培養(yǎng)后長出的菌絲在熒光顯微鏡下均能觀察到熒光，說明這4 種鏈格孢菌均能在棗樹花期通過棗花侵入棗樹，許陽[17]、趙樂等[40]、張敏[38]也都研究證明了棗縮果病互隔鏈格孢菌在花期即能侵入棗樹，且王森等[41]在觀察不同地區(qū)不同類型棗吊的開花期后發(fā)現(xiàn)，棗樹盛花期較長，為1 ～2 個月，所以必須重視在棗樹花期對棗縮果病的防治工作，從而更加有效地避免這類病原菌對棗樹的危害。

3.2 結(jié) 論

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了GFP 標記的蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌，在棗縮果病的研究中為開展病原菌對寄主的侵染研究提供了更加簡便有效的方法，同時證實了這4 種非棗屬植物寄主上的鏈格孢屬真菌對棗樹均有致病性，且在花期和幼果期均可以侵入棗樹，由此推測，這 4 種鏈格孢菌也都有可能成為棗縮果病的潛在病原菌，這一研究擴大了棗縮果病初侵染病原的研究范圍，并對棗園規(guī)劃和管理具有一定的指導(dǎo)意義。