陳瑞紅，林 俊，楊立新，楊木嬌，朱遠(yuǎn)茂，薛 飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動物傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150069）

牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的世界范圍內(nèi)牛傳染性地方病[1]。由于BVDV 的高感染率、持續(xù)性和臨床后果，BVD 已是畜牧業(yè)最大的實(shí)質(zhì)性傳染病。該病毒急性感染的臨床癥狀從無癥狀到輕度腹瀉不等，但由于其能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞減少以及免疫抑制（可長達(dá)6 周），使牛體容易繼發(fā)其它疾病，如乳房炎、肺炎和牛呼吸道疾病綜合征等，極具破壞性，甚至可能致命[2-3]。此外BVDV還可以引起生育能力降低和產(chǎn)奶量減少，胎兒生長緩慢，腹瀉，呼吸道癥狀及流產(chǎn)、畸形、胚胎吸收、胎兒木乃伊和死胎等生殖障礙[4]。在妊娠30 d～125 d 感染非致細(xì)胞病變生物型BVDV 的牛胎兒可以對該病毒產(chǎn)生免疫耐受，并在出生時呈持續(xù)感染（PI），終生帶毒[5]。由于PI 牛不斷向環(huán)境散播病毒，成為BVDV重要的傳染源。

BVDV 是一種小的單股正鏈RNA 病毒，其基因組全長約12.5 kb，屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員。BVDV 根據(jù)基因組5'-UTR 區(qū)差異可分為兩種基因型，即BVDV-1 和BVDV-2 型。BVDV-1 和BVDV-2型基因組的差異不大，病原流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國BVDV 流行株主要為BVDV-1 型[6]。BVDV 最具免疫原性的蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白Erns（E0）和E2 及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3（p80），三者均可應(yīng)用于檢測牛血清中針對BVDV 的抗體。其中針對p80 蛋白的抗體不能中和BVDV，但其易被血清學(xué)方法檢測到，因此p80 蛋白在BVDV 血清學(xué)診斷中很重要。p80 蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，它包含一個N-末端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和一個C-末端RNA 解旋酶[7-8]。p80 蛋白在病毒RNA復(fù)制和致細(xì)胞病變作用中起重要作用。該蛋白在瘟病毒中也具有高度保守性，并通過自然感染或接種BVDV 弱毒活疫苗誘導(dǎo)牛體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)p80蛋白后以純化的重組p80 蛋白作為包被抗原，建立了檢測BVDV 的間接ELISA 方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、菌種和血清 BVDV BA 株、重組 菌pET30-p80/BL21（DE3）[8]由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存；BVDV 標(biāo)準(zhǔn)參考陰性與陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）兔源陽性血清、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV)鼠源陽性血清、口蹄疫病毒（FMDV）鼠源陽性血清、牛副流感病毒3 型（BPIV3）豚鼠源陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）豬源陽性血清、符合率試驗(yàn)所用牛血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存；90 份牛血清由本實(shí)驗(yàn)室保存，188 份現(xiàn)地采集的牛血清（其中94 份來自西藏自治區(qū)的昌都，94 份來自甘肅省平?jīng)觯┯晒枮I獸醫(yī)研究所辛九慶研究員惠贈。

1.2 主要試劑 蛋白純化試劑購自GenScript公司；兔抗牛IgG-HRP購自Sigma公司；3，3，5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自北京泰天河生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker 購自Thermo Fisher Scientific 公司：96 孔ELISA可拆卸板購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；明膠購自Fluka AG 公司；脫脂乳購自博士德生物工程有限公司；馬血清購自Hyclone 公司。甘油購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；咪唑購自生物工程股份有限公司；尿素購自AMRESCO 公司。

1.3 重組p80蛋白的表達(dá)、鑒定與純化 將pET30a-P80/BL21（DE3）接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD450nm在0.6 至0.8 時加入終濃度1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌液，8 000 r/min 離心6 min 后將PBS 重懸的沉淀進(jìn)行超聲破碎，收集上清及沉淀。將收集的上清及沉淀經(jīng)SDS-PAGE 鑒定其蛋白表達(dá)形式。利用尿素法在變性條件下將重組蛋白p80 經(jīng)鎳柱進(jìn)行蛋白純化，經(jīng)復(fù)性純化后得到了可溶性的重組p80 蛋白，SDS-PAGE 檢測純化的重組p80 蛋白，采用BCA 試劑盒測其濃度，分裝后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA 方法的優(yōu)化與建立 采用方陣滴定法 對p80 蛋 白 包 被 濃 度（2.51 μg/孔、1.26 μg/孔、0.84 μg/孔、0.63 μg/孔、0.503 μg/孔)，BVDV 陽性血清稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000）進(jìn)行優(yōu)化；在確定抗原包被濃度及血清稀釋比例后，對封閉液（5%脫脂乳、10%馬血清、1%明膠、2%明膠、3%明膠）、封閉時間（4 ℃過夜、37 ℃1 h、37 ℃2 h）、血清孵育時間（37 ℃0.5 h、37 ℃1 h、37 ℃1.5 h）、兔 抗 牛IgG-HRP 稀 釋 度（1∶5 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶15 000）、兔抗牛IgG-HRP 孵育時間（0.5 h、1 h、1.5 h）及TMB 顯色時間（5 min、10 min、15 min、20 min）進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.5 間接ELISA 陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的建立 利用已優(yōu)化的間接ELISA 對經(jīng)病毒中和試驗(yàn)確定為陰性的50份牛血清進(jìn)行檢測，計算OD450nm值的平均值（）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD），以+3SD 值作為判定陰陽性血清的標(biāo)準(zhǔn)；高于該值判為陽性，低于該值判為陰性。

1.6 特異性試驗(yàn)

1.6.1 阻斷試驗(yàn) 將8 份樣品（4 份經(jīng)中和試驗(yàn)鑒定為陽性的血清、4 份經(jīng)中和試驗(yàn)鑒定為陰性的血清）與BVDV 病毒液按1∶1 混合，在37 ℃孵育2 h，之后按建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測，根據(jù)阻斷前后的OD450nm值變化判定阻斷效果。

1.6.2 交叉阻斷反應(yīng)試驗(yàn) 以建立的間接ELISA 方法與IBRV 兔源陽性血清、BRSV 鼠源陽性血清、FMDV 鼠源陽性血清、BPIV3 豚鼠源陽性血清、CSFV 豬源陽性血清進(jìn)行阻斷試驗(yàn)，各設(shè)立2 個重復(fù)。具體操作過程為：先用IBRV 兔源陽性血清、BRSV鼠源陽性血清、FMDV 鼠源陽性血清、BPIV3 豚鼠源陽性血清或CSFV 豬源陽性血清加入重組P80 蛋白包被的ELISA 板中孵育1 h，去掉血清洗滌3 次。然后加入BVDV 的牛陽性血清再次孵育1 h，同時設(shè)BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陰性與陽性血清分別作為對照。根據(jù)阻斷前后的OD450nm值變化判定阻斷效果。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將BVDV 陽性血清用10%馬血清倍比（1∶10～1∶2 560）稀釋后，利用本研究建立的間接ELISA 方法檢測，同時利用病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測，比較二者結(jié)果，確定本研究建立的的間接ELISA 方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取4 份BVDV 陽性血清樣品，用同一批次純化蛋白包被的ELISA 板的進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，每份血清設(shè)置8 個重復(fù)；以4 個不同批次純化的重組蛋白包被后，進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，設(shè)置4 批重復(fù)。計算批間和批內(nèi)變異系數(shù)，評估該ELISA 方法的重復(fù)性。

1.9 符合率試驗(yàn) 選取本實(shí)驗(yàn)室保存的90 份牛血清，利用本研究建立的間接ELISA 和病毒中和試驗(yàn)同時檢測，判定兩種檢測方法的符合率。

1.10 臨床牛血清的檢測 取188 份牛血清，按照本試驗(yàn)建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測，統(tǒng)計血清陽性檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 重組p80 蛋白的表達(dá)鑒定與純化 將pET30ap80/BL21（DE3）菌液誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示，沉淀泳道在44 ku 處有目的條帶，與預(yù)期P80 蛋白蛋白大小一致。純化后P80 蛋白濃度為0.503 mg/mL。表明p80 蛋白獲得表達(dá)，并且以包涵體形式存在（圖1），經(jīng)鎳柱在變性條件下純化純化效果較好。

圖1 重組蛋白p80 的SDS-PAGE 鑒定Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant p80 after ultrasonic disruption

2.2 間接ELISA 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化及臨界值的確定 以p80 蛋白所建立的間接ELISA 方法的主要反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果見表1。將經(jīng)ELISA 方法確定為BVDV 陰性的50 份牛血清的OD450nm值進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示其呈正態(tài)分布（圖2），經(jīng)計算該方法的臨界值為0.314，即OD450nm值高于0.314 判為陽性，低于0.314 判為陰性。

2.3 特異性試驗(yàn)

2.3.1 阻斷試驗(yàn)結(jié)果 利用陰陽性血清進(jìn)行病毒阻斷試驗(yàn)，結(jié)果顯示4 份陽性血清OD450nm值下降均在39%以上，而4 份陰性血清經(jīng)病毒阻斷以后OD450nm值基本無變化（表2）。表明BVDV 的病毒液能夠有效地阻斷包被抗原與陽性血清的反應(yīng)，且包被的抗原有具較強(qiáng)的特異性。

表1 間接ELISA 方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

圖2 50 份牛陰性血清間接ELISA 檢測結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.2 Detection of 50 negative serum samples by the indirect ELISA

2.3.2 交叉阻斷試驗(yàn)結(jié)果 采用本研究建立的方法檢測IBRV 兔源陽性血清、BRSV 鼠源陽性血清、FMDV 鼠源陽性血清、BPIV3 豚鼠源陽性血清、CSFV 豬源陽性血清，結(jié)果顯示上述5 種病毒的陽性血清均未阻斷BVDV 陰陽性血清的反應(yīng)（圖3），重組蛋白與5 種病毒陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。表明該方法較強(qiáng)的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 利用本試驗(yàn)建立的ELISA 方法對不同稀釋度的BVDV 陽性血清（1∶20～1∶2 560）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的方法陽性血清稀釋度檢測下限為1∶1 280，而病毒中和試驗(yàn)陽性血清稀釋度檢測下限為1∶512。表明本研究建立的間接ELISA 方法的敏感性較高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA 方法用同一批次包被的ELISA 板對4 份陽性血清進(jìn)行檢測，檢驗(yàn)所建立方法的批內(nèi)重復(fù)，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)小于10%；將上述4 份血清用不同批次包被的ELISA 板進(jìn)行批間重復(fù)，結(jié)果顯示批間重復(fù)變異系數(shù)小于10%（表3）。表明本試驗(yàn)建立的間接ELISA 方法具有良好的重復(fù)性。

表2 病毒阻斷試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Blocking test with BVDV

圖3 交叉阻斷試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The result of cross-reaction blocking tests

表3 間接ELISA 重復(fù)試驗(yàn)Table 3 Repeatability assay for indirect ELISA(n=4)

2.6 符合率試驗(yàn)結(jié)果 用病毒中和試驗(yàn)及本試驗(yàn)建立的ELISA 方法對90 份牛血清進(jìn)行檢測，其中經(jīng)ELISA 方法檢測出39 份陽性血清，51 份陰性血清；病毒中和試驗(yàn)檢測出35 份陽性血清，55 份陰性血清，二者的總符合率為95%，本試驗(yàn)建立的ELISA方法與病毒中和試驗(yàn)具有較高的符合率。表明該ELISA 方法檢測結(jié)果較準(zhǔn)確。

2.7 臨床樣品的檢測結(jié)果 將188 份現(xiàn)地采集的牛血清樣品利用本研究建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，其中陽性血清162 份（來自西藏自治區(qū)昌都的牛血清樣品有80 份為陽性，來自甘肅省平?jīng)龅呐Ｑ鍢悠酚?2 份為陽性），陰性血清樣品26份（來自西藏自治區(qū)昌都的牛血清有14 份為陰性，來自甘肅省平?jīng)龅呐Ｑ?2 份為陰性），血清抗體陽性總檢出率為86.2%。表明上述兩個地區(qū)BVDV的感染率較高，本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA 方法可用于臨床檢測。

3 討 論

BVDV 感染牛能夠引發(fā)廣泛的臨床癥狀，對養(yǎng)牛業(yè)產(chǎn)生巨大的影響。BVDV 還可以感染綿羊、山羊、豬、水牛、麋鹿等其它動物，存在種間傳播，已有實(shí)驗(yàn)證明BVDV 在綿羊和牛之間存在傳播[9]。我國牛群BVDV 血清抗體陽性率普遍很高，西部地區(qū)群陽性率為84.38%，個體陽性率為61.88%，其中乳用牛個體陽性率為85.37%，顯著高于肉用牛（47.67%）和種用牛（48.62%）[10]。因此，建立快捷有效的BVDV 檢測方法對BVDV 的有效防控具有重要意義。

目前，BVDV 的檢測主要包括兩個方面，一個是針對BVDV 病原的檢測，另一個是針對BVDV 抗體的檢測。BVDV 病原檢測方法主要有病毒分離、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組化（IHC）等，BVDV 病原檢測除了可以檢測急需感染牛，還可以檢出PI 牛。病毒分離是BVDV 病原檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，工作量大，檢測周期長，要求病料新鮮；免疫組化靈敏性高，可以檢測出PI 牛，但不適宜大規(guī)模檢樣；RT-PCR 可以用于大量檢樣品的檢測，都可用于PI 牛的篩查，但需要特定儀器[11]。BVDV 抗體的檢測方法主要有中和試驗(yàn)和ELISA。中和試驗(yàn)特異性強(qiáng)，是抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測過程繁瑣，周期長。ELISA 試驗(yàn)簡單快捷，且適合大批量樣品檢測。BVDV 抗體檢測有助于了解牛群BVDV 的感染情況和動態(tài)。E0 和E2 蛋白是BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白，是其主要的免疫原，可誘導(dǎo)中和抗體，常常是抗體檢測的主要靶標(biāo)，但E0 和E2是糖蛋白，原核表達(dá)時容易丟失糖基化位點(diǎn)，加上BVDV 抗原變異快，現(xiàn)地的基因亞型眾多，用原核表達(dá)的E0 或E2 作為檢測抗原存在漏檢的可能。p80蛋白是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性，病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制過程中其也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，也是BVDV 抗體檢測的主要靶標(biāo)。因此本研究利用大腸桿菌表達(dá)的重組p80 蛋白作為檢測抗原，建立了BVDV 血清抗體間接ELISA 檢測方法。目前國內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室用于抗體流行病學(xué)調(diào)查的診斷方法均不區(qū)分BVDV1 型和BVDV2 型，本實(shí)驗(yàn)室未有BVDV2 型特異性血清，而且國內(nèi)尚無BVDV2 型商品化血清，因此本研究建立的P80 抗體診斷方法對BVDV2 抗體檢出率如何，是否可以完全可用于BVDV2 抗體檢測有待進(jìn)一步研究。但是研究表明p80 基因在瘟病毒屬中非常保守，能夠識別由BVDV-1 和BVDV-2 型病毒引起的抗體[7]，本研究建立的P80 抗體檢測方法能夠滿足應(yīng)用需求。

相對于真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白量產(chǎn)量大，容易表達(dá)，且較易純化。因此，本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了p80 蛋白，用純化的重組p80 蛋白作為包被抗原，對封閉液、封閉時間、待檢血清稀釋度和孵育時間、二抗稀釋濃度和孵育時間及顯色時間進(jìn)行了優(yōu)化，建立了檢測BVDV 血清抗體的間接ELISA 方法。用IBRV 兔源陽性血清、BRSV 鼠源陽性血清、FMDV 鼠源陽性血清、BPIV3 豚鼠源陽性血清和豬瘟病毒豬源陽性血清進(jìn)行了交叉阻斷試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，表明本研究建立的診斷方法特異性強(qiáng)。本研究建立的間接ELISA 與病毒中和試驗(yàn)的符合率為95%，符合率較高；對188 份現(xiàn)地采集的牛血清樣品進(jìn)行了檢測，其中94 份來自西藏自治區(qū)昌都，94 份來自甘肅省平?jīng)?，結(jié)果顯示BVDV 抗體陽性率昌都為85.1%（80/94），平?jīng)鰹?7.2%（82/94），總體為86.2%（162/188），再次印證我國西部地區(qū)的BVDV 感染率較高[10]。

綜上所述，本研究建立的BVDV P80 抗體檢測方法特異性強(qiáng)，符合率高，穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于國內(nèi)BVDV 的血清流行病學(xué)調(diào)查，為相關(guān)疫病的防控提供了一種有效的檢測技術(shù)手段。