馬 波，戚?；?，張文晶，陳浩田，張 琪，常 蕊，劉 悅，張雪蓮，張桂紅，王君偉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）和鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV）引起雛鴨的一種傳播迅速、高度致死的病毒性疾病[1]。DHAV屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬成員，其成員按照基因型分為A、B、C型，分別對應(yīng)傳統(tǒng)的DHV-I、臺灣新型DHAV 和韓國新型DHAV，該3 型 也 分 別 稱 為DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3，各型間無交叉保護(hù)或弱交叉保護(hù)[2-4]。我國DVH 主要由DHAV-1 和DHAV-3 引起，且生產(chǎn)實踐中常發(fā)生DHAV-1 和DHAV-3 的混合感染[5-7]，因此對DVH 的防控重點就是控制DHAV-1 和DHAV-3 的流行，而血清抗體的檢/監(jiān)測對于了解疫病的流行情況和制定合理的免疫程序尤為重要。

ELISA 是血清抗體檢測簡單而準(zhǔn)確的方法，目前建立了多種以DHAV 重組結(jié)構(gòu)蛋白或純化的全病毒為包被抗原的ELISA 抗體檢測方法。DHAV 含有VP0、VP1、VP3 3 種結(jié)構(gòu)蛋白，且均具有抗原性，其中VP1 是主要保護(hù)性抗原，同時VP1 也是DHAV不同病毒株間高度變異的區(qū)域[4,8]，而VP0 和VP3 則相對保守[2]。鑒于以上特點以重組VP1 蛋白為檢測抗原的ELISA 方法相對較多，Liu Ming[9]、張蕾[10]、卿莉[11]、銀鳳桂[12]、馬秀麗[13]等分別建立了以DHAV-1 VP1 為診斷抗原的檢測其同型抗體的ELISA方法及cELISA方法，楊發(fā)龍建立了以DHAV-3 VP1為診斷抗原的檢測其同型抗體的ELISA 方法，但該方法與DHAV-1 抗體存在交叉反應(yīng)，其可能作為檢測DHAV-1 和DHAV-3 抗體的通用型ELISA 方法[14]；沈友林[15]及董劍梅[16]等均建立了以DHAV-3 重組VP3為檢測抗原檢測其同型抗體的ELISA 方法，其中沈友林所建方法與DHAV-1 抗體存在交叉反應(yīng)，其可能成為同時檢測DHAV-1 和DHAV-3 感染的通用方法；陳敏[17]、齊曉燕[18]及劉帥帥[19]分別建立了以DHAV-1 重組VP0 和截短VP0 為檢測抗原的同型抗體檢測方法，其中劉帥帥的研究表明截短VP0 比截短VP1 更易表達(dá)，且截短VP0 的反應(yīng)性及敏感性均優(yōu)于截短VP1 蛋白；張玉瑤將DHAV-1 VP3 和DHAV-3 VP1 串聯(lián)原核表達(dá)產(chǎn)物作為檢測抗原，建立了可檢測DHAV-1 和DHAV-3 二價陽性血清的ELISA 方法[20]；曹瑩瑩[21]及何玲[22]分別建立了以DHAV-1 和DHAV-3 的VP2、VP4 為檢測抗原的檢測同型抗體的ELISA 方法，結(jié)果表明以VP2 為檢測抗原優(yōu)于以VP4 為檢測抗原的檢測效果；劉偉[23]、張怡澤[24]建立了以全病毒為檢測抗原的檢測同型抗體的ELISA 方法。

綜上所述，目前尚未見成熟的可同時檢測DHAV-1 及DHAV-3 抗體的通用型ELISA 方法，因此本研究比較DHAV-1 和DHAV-3 3 種結(jié)構(gòu)蛋白免疫反應(yīng)性差異，并篩選出適合作為通用檢測抗原的結(jié)構(gòu)蛋白，利用該蛋白為檢測抗原建立可檢測DHAV-1 和DHAV-3 血清抗體的通用ELISA 方法，為我國當(dāng)前DVH 的有效防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清及實驗動物 DHAV-1 E53 株和DHAV-3 GD 株病毒尿囊液、118 份鴨陰性血清、用于符合率試驗的46 份鴨血清及鴨源GPV 陽性血清、DEV 陽性血清均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室保存；H9N2 AIV 陽性血清及DTMUV 陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；20 只未免疫DHAV 疫苗的成年鴨購自黑龍江省哈爾濱市阿城養(yǎng)鴨場。

1.2 質(zhì)粒及主要試劑 重組菌pET30a-DHAV-1-VP0（VP3）/Rosetta、pET30a-DHAV-3-VP0（VP3）/Rosetta、pET-32a-DHAV-1-VP1/Rosetta、pET-32a-DHAV-3-VP1/Rosetta 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室構(gòu)建；Ni-NTA 親和層析純化試劑盒購自Gen-Script 公司；山羊抗鴨HRP-IgG（H+L）購自美國KPL生物有限公司；DHAV 抗體（DHAV-Ab）ELISA 檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；DNA Marker 和蛋白Marker 購自TaKaRa 公司；ECL 顯色液購自碧云天生物工程公司；脫脂奶粉購自BD 公司；IPTG 購自Sigma 公司。

1.3 DHAV-1 和DHAV-3 鴨抗血清的制備與檢測采用胸肌注射的方式， 將DHAV-1 E53 株和DHAV-3 GD 株病毒尿囊液分別免疫7 只成年鴨，另設(shè)6 只鴨不做任何處理作為陰性對照，免疫前均采血；首免劑量為2×104.3ELD50/羽份，首免2 周后第二次免疫，免疫方式同前，免疫劑量為首免的2倍，二免后每隔7 d 采血一次；二免12 周后第三次免疫，免疫方式同前，免疫劑量為首免的2倍，三免后每隔7 d采血一次；共采血19 次，采血的方式為翅下靜脈采血，分離血清后凍存?zhèn)溆?。采?.4 所述western blot方法檢測收集的免疫鴨血清抗體，并區(qū)分強(qiáng)陽性、弱陽性免疫血清，用于后續(xù)相應(yīng)的研究。

1.4 DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 重組蛋白的制備及免疫反應(yīng)性的檢測 將重組菌pET30a-DHAV-1-VP0（VP3）/Rosetta、pET30a-DHAV-3-VP0（VP3）/Rosetta、pET-32a-DHAV1-VP1/Rosetta、pET-32a-DHAV-3-VP1/Rosetta 經(jīng)常規(guī)方法誘導(dǎo)DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 蛋白表達(dá)[11]。目的蛋白通過Ni2+-NTA 瓊脂糖凝膠柱純化[12]后，以1∶1 000 稀釋的DHAV-1/-3二免后第6 周的鴨陽性血清為一抗，以1∶2 000 稀釋山羊抗鴨HRP-IgG 為二抗，進(jìn)行重組目的蛋白的western blot 檢測。

以純化的重組DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 蛋白1 μg/mL 包被ELISA 反應(yīng)板，100 μL/孔，以1∶100稀釋的DHAV-1/-3 二免后第6 周的鴨陽性血清為一抗，1∶400 稀釋的山羊抗鴨HRP-IgG 為二抗，進(jìn)行ELISA 檢測，分析各重組蛋白對DHAV-1/-3 二免后第6 周的同型血清抗體和異型血清抗體的免疫反應(yīng)性。

1.5 間接ELISA 方法的建立

1.5.1 間接ELISA 最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過棋盤滴定方法，分別將純化的DHAV-1/-3 VP0 重組蛋白稀釋為2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL后，分別以100 μL/孔包被ELISA 板，將陰陽性血清以1∶20、1∶50、1∶100、1∶500 和1∶1 000 倍 稀 釋后，以100 μL/孔加入ELISA 板，測定OD450nm值，并比較P/N 值以篩選出最佳通用型檢測抗原；在抗原和血清抗體的最佳反應(yīng)劑量確定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對抗原包被時間（37 ℃2 h、4 ℃過夜、37 ℃1 h 后4 ℃過夜、37 ℃2 h 后4 ℃過夜）、5%脫脂乳封閉時間（30 min、60 min、90 min 和120 min）、血清最佳作用時間（30 min、60 min、90 min 和120 min）、山羊抗鴨HRP-IgG 稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600）及作用時間（30 min、60 min、90 min和120 min）、TMB 底物顯色時間（5 min、10 min、15 min 和20 min）等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.2 陰陽性臨界值的確定 將收集的118 份鴨陰性血清，在最佳的反應(yīng)條件下進(jìn)行間接ELISA 測定，以確定鴨血清在無DHAV-1/-3 感染時其OD450nm值，并對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算平均值（）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理判定血清樣本的OD450nm≥±3 SD 為陽性，OD450nm±2 SD 為陰性，±2 SD≤≤±3 SD 為可疑。

1.6 特異性試驗 利用1.5 建立的間接ELISA 方法分別檢測鴨源GPV、DEV、H9N2 AIV 和DTMUV 陽性血清，并設(shè)DHAV-1/-3 陽性血清對照及陰性血清對照（未作任何免疫的鴨血清），每個樣品重復(fù)2次，進(jìn)行該方法的特異性檢測。

1.7 敏感性試驗 從1.3 分別免疫DHAV-1/-3 獲得的不同抗體水平的鴨血清中，選擇強(qiáng)陽性、弱陽性及陰性血清各3 份，將各血清2 倍倍比稀釋（1∶20～1∶2 560）后，按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA 方法的敏感性檢測。

1.8 重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)試驗：采用同一批次以DHAV-1 VP0 包被的酶標(biāo)板，利用1.5 建立的間接ELISA 方法，于不同時間對1.3 獲得的6 份不同抗體水平的DHAV-1/-3 鴨血清樣品進(jìn)行檢測，每份做6個重復(fù)；批間重復(fù)試驗：采用不同批次以DHAV-1 VP0 包被的 酶標(biāo)板，對1.3 獲得的6 份不同抗體水平的DHAV-1/-3 鴨血清樣品進(jìn)行檢測，每份做6 個重復(fù)；同時設(shè)立陰性對照，對批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算變異系數(shù)（CV=S/-X×100%，S：標(biāo)準(zhǔn)差，-X：算術(shù)平均值）。

1.9 符合率試驗 利用本研究建立的間接ELISA方法和DHAV-Ab ELISA 檢測試劑盒同時檢測46 份鴨血清樣本，比較兩種方法的檢測結(jié)果并計算二者的符合率。

1.10 臨床樣本的檢測 利用本研究建立的間接ELISA 方法，對1.3 免疫后不同時間獲得的的全部鴨血清樣品進(jìn)行抗體消長規(guī)律的測定。

2 結(jié) 果

2.1 DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 重組蛋白的免疫反應(yīng)性鑒定 將純化后的DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 6段重組蛋白進(jìn)行western blot檢測，結(jié)果顯示重組VP0、VP1 蛋白可同時與DHAV-1/-3 的血清抗體發(fā)生反應(yīng)，但重組DHAV-1 VP3 蛋白僅與DHAV-1 的血清抗體反應(yīng)，DHAV-3 VP3 蛋白僅與DHAV-3 的血清抗體反應(yīng)（圖1）。表明重組VP0 和VP1 均具有交叉免疫反應(yīng)性，可作為DHAV抗體檢測的通用型診斷抗原。

圖1 DHAV-1/-3 VP0、VP1 和VP3 蛋白免疫反應(yīng)性的western blot 檢測結(jié)果Fig. 1 Reactionogenicities analysis of recombinant protein VP0,VP1,VP3 with DHAV-1/-3 by western blot

分別以純化的重組DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 6 段蛋白為包被抗原，進(jìn)行同型及異型血清抗體的ELISA 檢測。結(jié)果顯示，3 種結(jié)構(gòu)蛋白與異型血清均存在不同程度的交叉反應(yīng)，且表現(xiàn)為DHAV-1 的3 種重組結(jié)構(gòu)蛋白與DHAV-3 陽性血清交叉免疫反應(yīng)性均強(qiáng)于DHAV-3 的3 種重組結(jié)構(gòu)蛋白與DHAV-1 陽性血清的交叉免疫反應(yīng)性，因此DHAV-1 的重組結(jié)構(gòu)蛋白更適合作為檢測抗原；DHAV-1 重 組VP0、VP1、VP3 的ELISA 結(jié) 果 顯 示，VP1 及VP3 的P/N 值 高 于VP0 的P/N 值，而VP0 及VP1 與異型陽性血清交叉免疫反應(yīng)的穩(wěn)定性優(yōu)于VP3，所以重組VP0 和VP1 可作為DHAV 抗體檢測的通用型診斷抗原，該結(jié)果與westren blot 結(jié)果一致（圖2）。根據(jù)以上結(jié)果本研究選擇DHAV-1 VP0 進(jìn)行后續(xù)研究（具體原因見討論）。

圖2 重組DHAV-1/-3 VP0、VP1 和VP3 蛋白免疫反應(yīng)性的間接ELISA 檢測結(jié)果Fig.2 Reactionogenicities analysis of recombinant protein VP0,VP1,VP3 of DHAV-1/-3 by indirect ELISA

2.2 間接ELISA 方法的建立

2.2.1 間接ELISA 方法最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果通過方陣滴定試驗優(yōu)化的間接ELISA 反應(yīng)條件：DHAV-1 VP0 抗原包被濃度為0.25 μg/mL，37 ℃作用2 h 后4 ℃過夜；5%脫脂乳37 ℃封閉90 min；待檢血清稀釋度為1∶100，37 ℃孵育60 min；1∶400 稀釋的山羊抗鴨HRP-IgG 37 ℃孵育60 min；底物避光顯色15 min。

2.2.2 陰陽性臨界值的確定 將收集的118 份鴨陰性血清，按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA 測定，測得的所有鴨陰性血清OD450nm值在0.12～0.26 之間，且符合正態(tài)分布（圖3）。結(jié)果顯示，陰性血清的OD450nm平均值（）為0.180，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.042，±3 SD 為臨界值為0.307，經(jīng)計算檢測的血清樣本為OD450nm≥X±3 SD（0.307）判定為陽性，OD450nm±2 SD（0.264）判定為陰性，OD450nm值介于0.264～0.307 之間判定為可疑。

圖3 鴨陰性血清間接ELISA 檢測結(jié)果的正態(tài)分布圖Fig.3 Normal distribution of ELISA detection result for duck negative serum

2.3 特異性試驗結(jié)果 利用建立的間接ELISA 方法分別檢測鴨源GPV、DEV、H9N2 AIV 和DTMUV 的陽性血清，結(jié)果顯示該ELISA 方法與上述陽性血清抗體均無交叉反應(yīng)，與DHAV-1 和DHAV-3 的鴨陽性血清反應(yīng)呈陽性（圖4），表明該方法特異性較強(qiáng)。

圖4 間接ELISA 特異性試驗結(jié)果Fig.4 The specificity assay of the indirect ELISA

2.4 敏感性試驗結(jié)果 分別選擇不同抗體水平的DHAV-1 和DHAV-3 鴨陽性血清各3 份，將血清2 倍倍比稀釋（1∶20～1∶2 560）后，按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA 檢測。結(jié)果顯示，檢測DHAV-1 強(qiáng)弱陽性血清時的敏感性達(dá)到1∶640，檢測DHAV-3 強(qiáng)弱陽性血清時的敏感性為1∶320（圖5）。綜合考慮，將本研究建立的間接ELISA 方法的敏感性定為1∶320，敏感性較高。

圖5 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity assay of the indirect ELISA

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 按照本研究建立的間接ELISA 方法對6 份不同抗體水平的鴨陽性血清進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗，并計算變異系數(shù)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為0.57%～2.67%，批間變異系數(shù)為1.94%～6.05%，均小于10%（表1），表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 符合率試驗 利用本研究建立的間接ELISA 和商品化的ELISA 檢測試劑盒同時檢測46 份鴨血清樣品。結(jié)果顯示，本研究建立的間接ELISA 檢出DHAV 陽性血清為30 份，陽性檢出率為65.2%；商品化的ELISA 檢測試劑盒檢出陽性血清樣品28 份，陽性檢出率為60.9%，二者的陽性符合率為93.3%，陰性符合率為88.9%，兩種方法的總符合率為95.7%（表2）。表明所建立的間接ELISA 方法與商品化的試劑盒總體符合率較高，檢測結(jié)果比較可靠。

表1 間接ELISA 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 Repeatability assay of the indirect ELISA(n=6)

表2 符合率試驗結(jié)果Table 2 Result of coincidence rate

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果 利用本研究建立的間接ELISA 方法分別檢測免疫DHAV-1 和DHAV-3 共19 周次的鴨血清抗體水平。結(jié)果顯示，DHAV-1/-3免疫鴨抗體消長規(guī)律呈現(xiàn)一致變化趨勢，血清抗體均在首免后第2 周轉(zhuǎn)為陽性，二免后第6 周血清抗體達(dá)到高峰，峰值為1.235，而后抗體水平逐漸下降，到二免12 周時血清抗體仍呈陽性，三免后血清抗體快速回升（圖6）。表明所建立的間接ELISA 方法可以用于臨床血清樣本的定性及定量檢測。

圖6 DHAV-1/-3 免疫鴨血清抗體消長規(guī)律檢測結(jié)果Fig.6 Monitoring the level of antibodies in ducks immunized with DHAV-1 and DHAV-3

3 討 論

DHAV-1 和DHAV-3 混合感染的情況在我國十分普遍[5-7]，因此建立可檢測DHAV-1/-3 血清抗體的通用型檢測方法，對于該病的有效防控具有重要意義。已有文獻(xiàn)報道分別以重組的DHAV-1 VP3 及DHAV-3 VP1 建立的ELISA 方法可用于DHAV-1/-3血清抗體的檢測[14-15]，但對于異型血清抗體的檢測沒有詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持。本研究在比較DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 結(jié)構(gòu)蛋白交叉反應(yīng)性的基礎(chǔ)上，綜合考慮確定以DHAV-1 VP0 重組蛋白為通用檢測抗原，建立了可同時檢測DHAV-1/-3 血清抗體的間接ELISA 方法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，為DHAV 抗體的檢/監(jiān)測提供了候選技術(shù)手段。

本研究團(tuán)隊研究初期，隨機(jī)選取了14 株DHAV-1 和DHAV-3 結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行氨基酸的同源性分析，結(jié)果顯示VP0 的同源性最高為90.43%，VP1和VP3 的同源性分別為87.40%和88.82%， 可見VP0較為保守，這與文獻(xiàn)報道的同源性結(jié)果一致[2]。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了DHAV-1/-3 VP0、VP1、VP3 結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)western blot 和間接ELISA 檢測進(jìn)一步證實，3 種重組結(jié)構(gòu)蛋白與異型血清均存在不同程度的交叉反應(yīng)性，且DHAV-1 的3種重組結(jié)構(gòu)蛋白與異型血清的交叉反應(yīng)性強(qiáng)于DHAV-3 3 種重組結(jié)構(gòu)蛋白與異型血清的交叉反應(yīng)性。且當(dāng)血清1∶1 000 稀釋進(jìn)行western blot 檢測時，VP0 和VP1 仍與DHAV 兩種型的陽性血清抗體反應(yīng)，而VP3 僅與同型陽性血清抗體發(fā)生反應(yīng)；當(dāng)DHAV 陽性血清抗體1∶100 稀釋進(jìn)行間接ELISA 檢測時，VP0、VP1、VP3 均表現(xiàn)與異型血清的交叉反應(yīng)性，其中VP1 的交叉反應(yīng)性最強(qiáng)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道VP1 的免疫原性最好一致，表明VP1 存在較多的抗原表位[9-15,25]；而VP0、VP1 與異型血清抗體交叉反應(yīng)性強(qiáng)于VP3。VP3 在血清抗體稀釋度較低時（ELISA）表現(xiàn)較好的交叉反應(yīng)性，而在血清稀釋度較高時（western blot）不表現(xiàn)交叉反應(yīng)性，表明VP3 的交叉反應(yīng)性存在抗體濃度依賴性，綜上所述，VP0、VP1 適合作為檢測DHAV 抗體的群特異性抗原，而VP3 依據(jù)所建立檢測方法的敏感性有可能成為檢測DHAV 抗體的型特異性抗原。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，VP1 與VP0 相比，VP1 的免疫反應(yīng)性強(qiáng)于VP0，但本研究在重組VP1 表達(dá)及純化過程中遇到瓶頸，優(yōu)化表達(dá)條件及更換載體，均不能改變其表達(dá)量偏低的情況，這與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[11,19,26]，且本研究顯示VP0 不僅表達(dá)量高，而且以包涵體和可溶性兩種方式表達(dá)均便于純化，其與異型血清抗體反應(yīng)的穩(wěn)定性較好，P/N 值滿足檢測需求，且VP0 的保守性更好，所以本研究綜合考慮最終選擇VP0 作為檢測DHAV-1 和DHAV-3 血清抗體的通用型ELISA 診斷抗原并建立相應(yīng)的ELSIA 檢測方法。

本研究建立的ELISA 方法均不與鴨常見病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性；批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)分別為0.57%～2.67%和1.94%～6.05%，重復(fù)性較好；選擇強(qiáng)陽性和弱陽性的血清檢測其敏感性為1∶320，且檢測同型血清抗體的敏感性略高；該方法與商品化ELISA 試劑盒檢測結(jié)果的符合率較高達(dá)到95.7%。利用所建立的ELISA 方法檢測DHAV-1/-3 免疫鴨血清抗體的消長規(guī)律，表明該方法可用于臨床血清樣本的抗體檢測。

綜上所述，本研究建立的檢測DHAV-1 和DHAV-3 抗體的通用型間接ELISA 方法，通過一次反應(yīng)可實現(xiàn)對DHAV-1 和DHAV-3 兩種型的血清抗體同時檢測，為今后DHAV 感染的檢測及二價疫苗免疫效果的評價提供了技術(shù)支持。