高 通，王 均，汪開毓，賀 揚(yáng)，樊 威，謝碧文，王永明，朱 婷，代小惠，張敏燕

（1. 內(nèi)江師范學(xué)院“長江上游魚類資源保護(hù)與利用”四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641100；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 魚病研究中心，四川 成都 611130；3. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，四川 內(nèi)江 641000；4. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130）

鰍科是鯉亞目現(xiàn)有魚類中的第二大科，在我國有18 個(gè)屬約100 多個(gè)種或亞種，廣泛分布于各大江河湖泊，因其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前已經(jīng)有多個(gè)種類被成功人工馴養(yǎng)。隨著鰍科魚類人工養(yǎng)殖的推廣，疾病問題也日益凸顯，目前已報(bào)道的疾病病原包括真菌、寄生蟲、細(xì)菌和病毒等，其中細(xì)菌性病原危害最嚴(yán)重。然而，相比較于其它養(yǎng)殖魚類，鰍科魚類相關(guān)細(xì)菌性疾病研究報(bào)道較少。上世紀(jì)九十年代劉立人等初次報(bào)道由細(xì)菌性病原引起泥鰍的赤鰭病，隨后黃軍報(bào)道了泥鰍的細(xì)菌性腸炎，但未對其病原進(jìn)行深入鑒定。鄭曙明等最早對長薄鰍腐皮病的病原采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察和生理生化檢測等方法進(jìn)行了研究，確定了該病病原為嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多鰍科魚類的細(xì)菌性病原被鑒定報(bào)道，如泥鰍體表紅點(diǎn)癥的病原遲緩愛德華氏菌[2]、臺(tái)灣泥鰍潰瘍癥的病原維氏氣單胞菌[3]和似鲇高原鰍出血、潰瘍癥的病原溫和氣單胞菌[4]等。但是，隨著鰍科魚類的養(yǎng)殖種類逐漸增多，不同鰍科魚類的病原也存在差異性，因此有必要全面了解不同鰍科魚類的病原類別，為養(yǎng)殖鰍科魚類的疾病防控奠定基礎(chǔ)。

花斑副沙鰍（Parabotia fasciata Dabry）隸屬鯉形目（Cypriniformes），鰍科（Cobitidae），副沙鰍屬（Paramisgurnus），是一種在我國廣泛分布的小型經(jīng)濟(jì)魚類，屬中國特有物種，與寬體沙鰍（Botia reevesae Chang）和中華沙鰍（Sinibotia superciliaris）等一并俗稱為“花泥鰍”[5-6]。花斑副沙鰍其肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，同時(shí)具有一定觀賞價(jià)值，但由于環(huán)境污染以及人工水利的修建，使其原有生境受到破壞，野生數(shù)量急劇減少[7]。為了保護(hù)生物多樣性，從2011 年開始，“長江上游魚類資源保護(hù)與利用”四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）開展了包括其移養(yǎng)馴化、人工繁殖、苗種培育和成魚養(yǎng)殖等有關(guān)的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究。但是，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的突破，疾病的危害也日漸凸顯，如在人工養(yǎng)殖過程中苗種培育早期的車輪蟲病，以及魚苗孵化及各生長階段出現(xiàn)的水霉病等[8]。但目前還未見關(guān)于其細(xì)菌性疾病感染的報(bào)道。

2017 年5 月，重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖車間的花斑副沙鰍幼鰍出現(xiàn)大量死亡，主要癥狀為食欲減退、離群、游動(dòng)緩慢或懸游，剖檢后發(fā)現(xiàn)鰭條基部、鰓、肝臟和腎臟等器官廣泛充血、出血，腸道發(fā)紅伴隨炎癥。本研究通過病原分離、鑒定、回歸試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)、毒力基因檢測和藥物敏感試驗(yàn)對該次發(fā)病花斑副沙鰍的病原進(jìn)行了分析，確定了該致病菌的種類、致病性、毒力基因攜帶情況和藥物敏感范圍，為花斑副沙鰍產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖過程中該疾病的防治提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 患病花斑副沙鰍來自“長江上游魚類資源保護(hù)與利用”四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖車間，選取體表出血明顯的患病鰍用于細(xì)菌接種。健康花斑副沙鰍由重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，體質(zhì)量5±0.5 g，于水族箱暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間不投餌，連續(xù)充氧，水溫25±2 ℃。

1.2 主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管和藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；2×Taq master mix 和細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 病原菌分離純化 按照無菌操作要求，采集患病花斑副沙鰍肝臟組織，在BHI 平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落，進(jìn)一步劃線純化，獲得純培養(yǎng)菌株（XQS1），再轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 將分離純化細(xì)菌接種BHI瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察細(xì)菌的生長特性與菌落形態(tài)，同時(shí)對菌體進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)特征。挑取單個(gè)菌落接種于微量生化管中，28 ℃下培養(yǎng)24 h～48 h，按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行生理生化特性鑒定。

1.5 分離菌的溶血性檢測 將滅菌的BHI 瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃～60 ℃后，加入5%的兔血，混勻倒平板，待兔血瓊脂培養(yǎng)基凝固后用打孔器打孔，并用2%的BHI 瓊脂封底。然后將純化的菌株XQS1 用生理鹽水調(diào)整濃度至6.0×107cfu/mL，取50 μL接種至5%的兔血BHI 瓊脂平板中，并以相同體積的生理鹽水作為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，觀察溶血情況。

1.6 分離菌的人工感染試驗(yàn) 根據(jù)科赫法則（Koch’s postulates）原理，進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。將健康花斑副沙鰍飼養(yǎng)于玻璃水族箱內(nèi)，每組20 尾，養(yǎng)殖用水為曝氣自來水，試驗(yàn)期間連續(xù)充氧。由于花斑副沙鰍發(fā)病期間水溫約25 ℃，因此暫養(yǎng)及試驗(yàn)期間水溫控制在25±2 ℃。實(shí)驗(yàn)水質(zhì)達(dá)到漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

將分離純化的細(xì)菌XQS1 接種于BHI 平板，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，用無菌生理鹽水洗下并調(diào)整濃度為6.0×108cfu/mL、6.0×107cfu/mL、6.0×106cfu/mL。將80尾健康花斑副沙鰍隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組，實(shí)驗(yàn)組按照0.05 mL/尾的劑量腹腔注射健康花斑副沙鰍，對照組腹腔注射相同體積的無菌生理鹽水。感染后連續(xù)觀察兩周，記錄魚的發(fā)病和死亡情況，并對死亡魚或?yàn)l死魚及時(shí)剖檢和分離細(xì)菌。

1.7 分離菌的16S rRNA 和gyrB 基因擴(kuò)增及序列測定分析 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA 作為PCR 模板。采用細(xì)菌16S 通用引物[9]及gyrB 基因引物[10]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min、54 ℃1 min、72 ℃2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將分離菌株的16S rRNA 基因序列和gyrB 基因序列與GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行BLAST 分析，利用MEGA 6.0 軟件包中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)抽樣1000 次分析系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支的置信度。

1.8 分離菌的毒力基因檢測 以菌株XQS1 的DNA為模板，采用PCR 方法進(jìn)行熱穩(wěn)定性腸毒素基因ast、毒性腸毒素基因act、熱不穩(wěn)定性腸毒素基因alt、氣溶素基因aer、溶血素基因hlyA 5 種毒力基因檢測。參考文獻(xiàn)[11-12] 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成擴(kuò)增上述毒力基因的引物，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由上述公司進(jìn)行序列測定。

1.9 分離菌的藥物敏感試驗(yàn) 將患病花斑副沙鰍中分離的菌株XQS1，采用紙片法檢測分離菌對17種常見抗菌藥（表1）的敏感性。根據(jù)藥敏紙片抑菌范圍確定藥物敏感情況。每種藥物重復(fù)3 次。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 從患病花斑副沙鰍肝臟組織中取樣，在BHI 平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，獲得1 株優(yōu)勢菌，編號(hào)為XQS1，該菌在BHI 平板培養(yǎng)基上生長較快，形成圓形、表面光滑、邊緣整齊、半透明狀凸起的灰白色菌落，革蘭染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。挑取單個(gè)菌落接種于微量生化管中，28 ℃下培養(yǎng)24 h～48 h，按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行生理生化特性鑒定。結(jié)果顯示，14 個(gè)鑒定項(xiàng)目中，菌株XQS1 對運(yùn)動(dòng)性、MR、賴氨酸脫羧酶、蔗糖、七葉苷、D-葡萄糖、麥芽糖、VP、氧化酶、吲哚反應(yīng)、以及檸檬酸鹽等11 個(gè)鑒定項(xiàng)目呈陽性反應(yīng)，對L-阿拉伯糖、H2S 產(chǎn)生以及丙二酸鹽等3 個(gè)鑒定項(xiàng)目呈陰性反應(yīng)。根據(jù)結(jié)果初步確定分離菌株XQS1應(yīng)為氣單胞菌屬（Aeromonas）。

圖1 菌株XQS1 革蘭氏染色（標(biāo)尺=10 μm）Fig.1 The gram staining result of XQS1(Bar=10 μm)

2.2 分離菌的溶血性檢測結(jié)果 菌株XQS1 在兔血BHI 瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)β溶血現(xiàn)象（圖2），表明該分離菌有較強(qiáng)致病性，可能為引起該次花班副沙鰍患病的病原。

2.3 分離菌的人工感染試驗(yàn)結(jié)果 利用分離菌株XQS1 感染后，腹腔注射組花斑副沙鰍在2 d～5 d 內(nèi)發(fā)病死亡，5 d 后停止死亡，3 個(gè)濃度組6.0×108cfu/mL、6.0×107cfu/mL、6.0×106cfu/mL 累計(jì)死亡率分別為85%（17/20）、75%（15/20）、60%（12/20）；對照組未發(fā)生死亡。人工感染發(fā)病鰍的主要癥狀表現(xiàn)為：串游或垂直懸停于水中，腹部嚴(yán)重出血、部分區(qū)域肌肉潰爛，肝臟、脾臟和腎臟嚴(yán)重充血或出血，腹腔內(nèi)有帶血樣腹水，腸道發(fā)炎、出血，以上癥狀與自然發(fā)病魚的癥狀相似；并從死亡魚肝臟和腎臟中分離到一種革蘭氏陰性短桿菌，且生理生化結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與菌株XQS1 一致，表明該細(xì)菌是引起該次花斑副沙鰍發(fā)病的主要病原菌。

2.4 分離菌的16S rRNA 基因和gyrB 基因PCR 擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 以菌株XQS1 基因組DNA 作為模板，16S rRNA 基因序列經(jīng)PCR 擴(kuò)增和電泳檢測后，顯示其目的條帶大小約為1 500 bp（圖3A），PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序，其長度為1 408 bp。將序列與GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果顯示：其與已知維氏氣單胞菌16S rRNA 基因序列一致性為99%以上。然后下載相似性最高的細(xì)菌和其它種屬細(xì)菌的16S rRNA 基因序列采用MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3B），結(jié)果顯示該菌株16S rRNA 基因與維氏氣單胞菌聚為同一支。該結(jié)果初步表明，菌株XQS1 為維氏氣單胞菌。

以菌株XQS1 基因組DNA 作為模板，gyrB 基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增和電泳檢測后，顯示其目的條帶大小約為1 200 bp（圖4A），PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，其長度為1 128 bp；將序列與GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果顯示：其與已知維氏氣單胞菌gyrB 基因序列一致性為98%以上，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該菌gyrB 基因與維氏氣單胞菌聚為同一支（圖4B）。結(jié)合以上一系列研究結(jié)果，確定本研究分離菌株XQS1是維氏氣單胞菌。

圖3 菌株XQS1 16S rRNA 基因PCR 產(chǎn)物（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹（B）Fig.3 The PCR product(A)and phylogenetic tree(B)of 16S rRNA gene of XQS1

圖4 菌株XQS1 gyrB 基因PCR 產(chǎn)物（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹（B）Fig.4 The PCR product(A)and phylogenetic tree(B)of gyrB gene of XQS1

2.5 分離菌的毒力基因檢測結(jié)果 以分離菌株XQS1的DNA 為 模 板，采 用 維 氏 氣 單 胞 菌ast、act、alt、aer、hlyA 5種毒力基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示未擴(kuò)增出ast基因，而另外4種毒力基因大小分別為232 bp、442 bp、431 bp和597 bp（圖5），經(jīng)測序鑒定與目的基因一致。表明XQS1 攜帶act、alt、aer、hlyA 4 種毒力基因，推測該菌株具有較強(qiáng)的毒力。

圖5 菌株XQS1 毒力基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The electrophoresis result of the virulence genes PCR products of XQS1

2.6 分離菌的藥物敏感試驗(yàn) 對分離菌XQS1 進(jìn)行了17 種藥物敏感性試驗(yàn)。28 ℃培養(yǎng)24 h 后，測定抑菌圈直徑并判定結(jié)果。結(jié)果顯示：該菌株對多西環(huán)素、諾氟沙星、氧氟沙星和氟苯尼考敏感；對多粘菌素B 介于敏感與耐藥之間；對其余抗生素均耐藥（表1）。這表明菌株XQS1 具有較強(qiáng)的耐藥性。

表1 菌株XQS1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The drug sensitivity test of XQS1

3 討 論

本研究從患病花斑副沙鰍肝臟中分離到一株優(yōu)勢菌（命名為XQS1），根據(jù)科赫法則，通過人工感染試驗(yàn)確定了該菌株為引起該次花斑副沙鰍發(fā)病死亡的主要病原。隨后，采用生理生化試驗(yàn)對菌株XQS1 進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果顯示：該菌株具有運(yùn)動(dòng)性，能夠利用多種糖類，但不能利用L-阿拉伯糖，且不產(chǎn)生H2S。與之前報(bào)到的虹鱒源維氏氣單胞菌[13]、異育銀鯽源溫和氣單胞菌[14]、青魚源嗜水氣單胞菌[15]等氣單胞菌屬細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果相似。由于同一屬中不同種細(xì)菌在生理生化方面可能相同，而且在不同的環(huán)境條件下生理生化結(jié)果也存在差異，因此生理生化鑒定結(jié)果只能推斷XQS1 為氣單胞菌屬細(xì)菌。

為了進(jìn)一步確定該致病菌種類，本研究采用16S rRNA 基因序列分析法進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示該序列與已知維氏氣單胞菌序列一致性達(dá)99%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，XQS1 與維氏氣單胞菌聚于一簇，初步確定該致病菌為維氏氣單胞菌。但由于16S rRNA 基因保守性較高、進(jìn)化速度較慢，無法區(qū)分親緣關(guān)系較近的細(xì)菌類群[16-17]，而gyrB 基因的進(jìn)化速率較16S rRNA 基因快，能夠?qū)⑼粚賰?nèi)親緣關(guān)系較近的細(xì)菌種類區(qū)分開來[18-19]。因此，本研究采用gyrB 基因?qū)QS1 再次進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)合傳統(tǒng)生理生化鑒定結(jié)果，最終確定該致病菌為維氏氣單胞菌。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)維氏氣單胞菌病例的報(bào)道逐漸增多，相關(guān)研究表明維氏氣單胞菌的毒力在逐漸增強(qiáng)，而毒力的強(qiáng)弱主要與菌株攜帶的毒力基因相關(guān)，目前已經(jīng)報(bào)道的維氏氣單胞菌的毒力基因包括：外膜蛋白、菌毛、鞭毛、氣溶素、溶血素、腸毒素、蛋白酶以及一些黏附因子等[20]。本研究對分離的致病性維氏氣單胞菌XQS1 進(jìn)行ast、act、alt、aer 和hlyA 5 種毒力基因特異性PCR 檢測，結(jié)果顯示該菌株攜帶act、alt、aer、hlyA 4 種毒力基因。已有報(bào)道顯示， aer 和hlyA 均屬于外毒素，能夠引起β溶血，致使宿主在感染致病性維氏氣單胞菌后出現(xiàn)出血現(xiàn)象[12]；alt 和act 均屬于細(xì)胞毒性腸毒素，可刺激宿主的促炎反應(yīng)，具有細(xì)胞毒性和溶血性[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然發(fā)病和人工感染花斑副沙鰍均表現(xiàn)出體表及內(nèi)臟器官的廣泛性出血，溶血性試驗(yàn)也顯示該菌株能夠使兔血呈β溶血。因此，推測致病性維氏氣單胞菌XQS1 的強(qiáng)毒性可能與攜帶了這些毒力基因有關(guān)。然而本研究未在維氏氣單胞菌XQS1中檢測到ast，這可能與不同菌株攜帶毒力基因差異性有關(guān)[21]。

為指導(dǎo)該病的臨床用藥，本研究進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示維氏氣單胞菌XQS1 僅對17 種抗菌藥物中的多西環(huán)素、諾氟沙星、氧氟沙星和氟苯尼考敏感，對其它所選藥物中度敏感或者耐藥。結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)以往臨床治療經(jīng)驗(yàn)，建議對發(fā)病花斑副沙鰍采用多西環(huán)素加維生素C 進(jìn)行治療。

本研究首次報(bào)道了維氏氣單胞菌對花斑副沙鰍的致病性，對其攜帶的毒力基因進(jìn)行了檢測，并通過藥敏試驗(yàn)篩選出了防治該病的敏感藥物，為花斑副沙鰍人工養(yǎng)殖中該疾病的防治提供了理論參考，但該菌對花斑副沙鰍的具體致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。