韓倩倩 曲明悅 薛彬 王春仁

皮膚修復(fù)材料作為近年來新的皮膚損傷修復(fù)方式，顯示出良好的前景。糖尿病足等難愈性創(chuàng)面的皮膚修復(fù)對材料的性能和有效性有更高的要求，本研究采用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并在其背部形成全層皮膚缺損創(chuàng)面，以構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚損傷模型，用于評價膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿和明膠生物活性玻璃復(fù)合材料對難愈性皮膚損傷的修復(fù)作用，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及溶液配制

檸檬酸鈉緩沖溶液配制：2.10 g檸檬酸加100 mL雙蒸水配成檸檬酸母液； 2.94 g檸檬酸三鈉加100 mL雙蒸水配成檸檬酸鈉母液；將檸檬酸母液和檸檬酸鈉母液按1∶1.32的比例混合，調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5，得到所需的0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖溶液。

STZ溶液配制：將STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，配成濃度為10 mg/mL的STZ溶液，用濾菌器過濾除菌后避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿(杭州英健生物科技有限公司)，明膠生物活性玻璃復(fù)合敷料(上海硅健生物材料有限公司)。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量約200 g(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病大鼠皮膚損傷模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成5組，每組8只。禁食一晚，空腹血糖<6.1 mmol/L的大鼠用于建立糖尿病大鼠模型。按照25 mg/Kg、50 mg/Kg、75 mg/Kg和100 mg/Kg的劑量腹腔注射STZ溶液，空白對照組注射檸檬酸鈉緩沖溶液。每天密切觀察所有試驗大鼠的一般情況。注射后第7、14、21和28天尾尖采血檢測非空腹血糖值。

將15只SD糖尿病大鼠隨機(jī)分成3組，麻醉，備皮，于雙耳連線中間向下大約8 cm處，以脊柱為中線分別切除1 cm×1 cm、2 cm×2 cm、3 cm×3 cm的正方形全層皮膚，深至肌層，用無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，醫(yī)用膠帶固定。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，第0、5、12、21天觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.3.2 三種材料對創(chuàng)面的有效性評價

將三種材料(膠原、羧甲基殼聚糖、明膠生物活性玻璃)剪至2 cm×2 cm大小。將80只SD糖尿病大鼠皮膚損傷模型隨機(jī)分為4組：空白對照組(n=20)、膠原組(n=20)、羧甲基殼聚糖組(n=20)、生物玻璃組(n=20)。膠原組、羧甲基殼聚糖組、生物玻璃組將相應(yīng)樣品直接敷在皮膚缺損創(chuàng)面，并用無菌敷料貼覆蓋；空白對照組直接用無菌敷料貼覆蓋創(chuàng)面。術(shù)后所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，每2天觀察實驗鼠的精神、活動和飲食變化，第3、7、14、21天打開敷料觀察創(chuàng)傷愈合與炎癥情況，拍照，作好觀察記錄，并在第14、21天取材進(jìn)行病理切片檢查。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 大體創(chuàng)面恢復(fù)情況

記錄造模后第3、7、14、21天大鼠創(chuàng)面滲出、黏連以及創(chuàng)口回縮等情況，大體判斷創(chuàng)面的恢復(fù)情況。

在34篇研究文獻(xiàn)中，我們可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的研究主要針對大學(xué)本科及以上的學(xué)生，而對于中小學(xué)的研究卻很少。即使是大部分實驗研究，實驗對象也更多是對于大學(xué)本科生，如畢鵬暉（2017）針對大二學(xué)生的問卷和訪談得出結(jié)果研究大學(xué)英語微移動詞匯學(xué)習(xí)融入形成性評估模式；李思縈、高原（2016）以4組非英語專業(yè)研究生為對象,通過測試考察了移動技術(shù)輔助外語教學(xué)與多模態(tài)結(jié)合對學(xué)習(xí)者詞匯習(xí)得的影響；孔繁霞、王歆（2014）基于“投入量假設(shè)”理論,探討了93名非英語專業(yè)二年級學(xué)生在閱讀、聽力、寫作任務(wù)中的詞匯附帶習(xí)得效果等。

1.4.2 創(chuàng)面愈合率

造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進(jìn)行拍照(距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro)測算創(chuàng)面愈合率。

1.4.3 組織學(xué)檢查

造模后第14、21天，在創(chuàng)面上切取約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的皮膚組織，宜包含周圍正常皮膚組織， HE染色后觀察各時間點各組大鼠皮膚創(chuàng)面的修復(fù)情況和肉芽組織生長、炎癥反應(yīng)等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型建立

注射STZ后，25 mg/Kg STZ組非空腹血糖值未到達(dá)糖尿病血糖標(biāo)準(zhǔn)(高于16.7 mmol/L)，動物精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤；50 mg/Kg STZ組部分大鼠非空腹血糖值>16.7 mmol/L，成模率為50%；75 mg/Kg STZ組所有大鼠血糖值均>16.7 mmol/L，動物精神狀態(tài)差，弓背捲體，動作緩慢，毛發(fā)無光澤，成模率100%；100 mg/Kg STZ組動物注射STZ后2 d內(nèi)死亡5只，4 d內(nèi)全部死亡。因此，確定以75 mg/Kg STZ單次腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型(圖1)。

圖1 各劑量組動物血糖變化情況Fig. 1 Changes of blood glucose in different concentration groups

2.2 皮膚損傷模型建立

圖2 術(shù)后第0、5、12、21天各組創(chuàng)面愈合情況Fig. 2 Skin wound healing at day 0, 5, 12, 21 after resection

2.3 三種修復(fù)材料的有效性評價

2.3.1 創(chuàng)面恢復(fù)情況

各組大鼠均未出現(xiàn)感染及死亡情況。術(shù)后第3天，空白對照組動物創(chuàng)面明顯紅腫、滲出，創(chuàng)面邊緣無收縮跡象；3種材料組的創(chuàng)面處均較干凈，無滲出，傷口邊緣皮膚開始向內(nèi)收縮。術(shù)后第7天，對照組仍有明顯滲出，傷口邊緣開始收縮；3種材料組傷口收縮明顯，創(chuàng)面均被肉芽組織填滿；術(shù)后第14天，對照組創(chuàng)面縮小，結(jié)痂；膠原組和生物玻璃組痂皮脫落，創(chuàng)面被新生的表皮覆蓋。術(shù)后第21天，空白對照組痂皮脫落，被新生表皮覆蓋；3個樣品組創(chuàng)面已基本愈合。

2.3.2 創(chuàng)面愈合率

造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進(jìn)行拍照(每只動物拍照距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro)測算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果顯示，術(shù)后第3、7、14和21天，膠原組和生物玻璃組的創(chuàng)面愈合率均高于空白對照組，且具有顯著性差異(P<0.01)；而羧甲基殼聚糖組的創(chuàng)面愈合率只在第3天略高于對照組，其余三個時間點均低于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 各組創(chuàng)面愈合率比較(**： P<0.01)Fig. 3 Wound healing rate of each group (**： P<0.01)

2.3.3 組織學(xué)檢查

術(shù)后第14天，膠原組和明膠生物玻璃組表皮已基本覆蓋全部創(chuàng)面，且出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，有小血管增生，皮膚附屬器清晰可見；羧甲基殼聚糖組仍有部分創(chuàng)面未被表皮覆蓋，未形成層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，真皮層內(nèi)可見毛細(xì)血管的閉合、退化和消失，未見皮膚附屬器；空白對照組部分創(chuàng)面無表皮覆蓋，仍可見較多的新生血管和成纖維細(xì)胞，無皮膚附屬器；術(shù)后第21天，膠原組和明膠生物玻璃組可見完整的皮膚結(jié)構(gòu)，可見皮膚附屬器；羧甲基殼聚糖組雖然仍未見皮膚附屬器長出，但出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)；空白對照組大部分創(chuàng)面已被表皮覆蓋，出現(xiàn)完整的皮膚結(jié)構(gòu)，雖然無皮膚附屬器長出，但創(chuàng)面已基本愈合(圖4)。

A：空白對照組；B：膠原組；C：羧甲基殼聚糖組；D：明膠生物玻璃組a: Control group; B: Collagen group; C: Carboxymethyl chitosan group; D: Gelatin bioactive glass group圖4 各組創(chuàng)面術(shù)后第14、21天組織學(xué)觀察Fig. 4 Histological observation on skin wound healing 14, 21 days after treatment

3 討論

正常的創(chuàng)面愈合涉及一系列級聯(lián)事件，包括止血/炎癥期、增殖期和重塑期[1]。各種炎癥因子、細(xì)胞因子、激素等參與修復(fù)反應(yīng)[2-6]。在嚴(yán)重的病理條件下，如燒傷、燙傷、糖尿病創(chuàng)面，所有這些形態(tài)學(xué)事件都受損，阻礙正常的再上皮化和真皮修復(fù)過程，是皮膚組織創(chuàng)傷治療中最主要的挑戰(zhàn)。近年來，皮膚修復(fù)材料替代物在治療皮膚損傷方面提供了新的機(jī)會。多種皮膚敷料，包括絲素蛋白[7-8]、海藻酸鈉[9-10]、殼聚糖[10-12]、膠原蛋白[13-14]和明膠[14-15]等，正被用于促進(jìn)愈合過程和保護(hù)皮膚免受進(jìn)一步損害。構(gòu)建合適的皮膚損傷模型，為皮膚修復(fù)材料有效性的驗證奠定基礎(chǔ)，是當(dāng)前面臨的重要任務(wù)。

糖尿病是胰島素分泌不足或胰島素作用障礙導(dǎo)致的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。糖尿病患者有10%～25%的幾率并發(fā)糖尿病足[16]，系由感覺神經(jīng)病變、足部畸形和動脈循環(huán)不足共同引起[17]，全球的發(fā)病率在4%～10%之間[18-19]。因此，構(gòu)建糖尿病大鼠的皮膚損傷模型，可有效模擬疾病的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r，為探索相關(guān)的發(fā)病機(jī)制及皮膚修復(fù)材料有效性提供基礎(chǔ)。

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)是一種能破壞胰島β細(xì)胞的抗生素，已被證明具有致糖尿病的特性[20]，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于Ⅰ型糖尿病的實驗研究[21-24]。此外，大鼠因大小適宜、誘導(dǎo)期短、易于誘導(dǎo)病情和成本效益[25]，具有明顯的優(yōu)勢，SD大鼠和Wistar大鼠對STZ尤為敏感，并且雄激素能增強(qiáng)大鼠對STZ誘導(dǎo)的糖尿病的敏感性[26]，因此本研究選用雄性SD大鼠，通過腹腔單次注射STZ溶液以構(gòu)建糖尿病模型。實驗結(jié)果顯示，100 mg/Kg STZ濃度過高，大量胰島β細(xì)胞壞死和胰島素突然釋放導(dǎo)致了致死性低血糖癥，引起大鼠死亡。75 mg/Kg的STZ注射后大鼠血糖符合標(biāo)準(zhǔn)(高于16.7 mol/L)，且有更高的成模率(100%)，因此確定75 mg/kg的STZ單次腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型。

在糖尿病大鼠背部分別進(jìn)行不同大小的全層皮膚切除，以尋找皮膚損傷模型的最佳創(chuàng)面大小。結(jié)果顯示，2 cm×2 cm組術(shù)后修復(fù)較1 cm×1 cm組平緩，利于皮膚修復(fù)材料有效性的比較。至此，標(biāo)準(zhǔn)化糖尿病大鼠皮膚損傷模型正式建立，即單次腹腔注射75 mg/kg STZ溶液，并在背部構(gòu)建2 cm×2 cm的全層皮膚缺損。

理想的創(chuàng)面敷料應(yīng)該使用方便，能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，無毒、非過敏、隔熱、不滲透細(xì)菌，允許適當(dāng)?shù)臍怏w交換并具有成本效益[27]。本研究中所使用的膠原蛋白[13]、羧甲基殼聚糖[28]、生物玻璃[29]促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用均有報道。本研究以糖尿病大鼠皮膚損傷模型來評價三種材料對于修復(fù)難愈性創(chuàng)面的有效性。大體觀察顯示，3種材料組的愈合情況均優(yōu)于對照組；創(chuàng)面愈合率比較顯示，膠原組和生物玻璃組術(shù)后第3、7、14、21天的愈合率均高于空白對照組，促進(jìn)皮膚愈合效果明顯，而羧甲基殼聚糖組因其明顯的止血效果，在恢復(fù)早期(第3天)效果較好，后期的創(chuàng)面愈合率均低于空白對照組，但無明顯差異，沒有促進(jìn)皮膚愈合的效果。HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后第14天，膠原組和生物玻璃組已出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，皮膚附屬器清晰可見，皮膚愈合程度明顯優(yōu)于對照組，羧甲基殼聚糖組仍未形成層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，未見皮膚附屬器，愈合效果不佳；術(shù)后第21天，各組動物皮膚均已基本愈合。

綜上所述，本研究利用STZ和背部皮膚全層損傷成功建立糖尿病大鼠皮膚損傷模型，膠原蛋白和明膠生物活性玻璃均可對難愈性皮膚損傷進(jìn)行有效修復(fù)，羧甲基殼聚糖僅表現(xiàn)為止血作用，未能有效促進(jìn)傷口愈合。